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2012csc

至尊木虫 (知名作家)

[求助] DH5α质粒的大量提取 已有2人参与

最近在用QIAGEN的maxi kit大量提取质粒,p2 p3 QBT QC 都是自己按说明书上配制的,第一次提取质粒的浓度非常小原液浓度在0.18ug/ul左右,第二次第三次提取浓度很大但是跑电泳没有目的条带,只有一片弥散的亮处,是P2裂解时间长了使基因组的DNA全都被打断了?浓度很高,nanodrop2000测浓度在15ug/ul左右,OD260/OD280大于2.2,资料上说RNA多,但RNA怎么可能有那么多,我感觉还是基因组DNA几乎打碎成核苷酸了,不知道推测是不是对的,因为自己配的P2可能要比厂家的更烈性一些。还有就是OD260/OD280为什么大于2.0就是RNA污染?RNA为什么会使OD260增加?还有什么情况能使OD260增加?加完P2后多久加P3?都说不超过5分钟,怎么判断裂解是否充分?上下颠倒几下,跟加完P1比稍微澄清一些就可以加P3了吧?如图,第二道就是第二次提取的,不知道是怎么回事~

DH5α质粒的大量提取
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坚持就是胜利!
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qingzfla

金虫 (正式写手)

P1加RNAse了吗?

一次洗脱回收量很少的,需要反复洗脱3次以上,可得到较大浓度的DNA.
学海无涯,做专业的人做专业的事
2楼2014-08-04 11:38:05
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

DNA和RNA降解后的OD值会增加,同时可能测浓度不准。
3楼2014-08-04 12:09:45
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qq376514009

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也有你的问题。a260/a280大于2。还有我也是自己配的所有buffer。 我看你的第三个line跑的还可以啊 我就没能跑出这样的。有没有什么经验可以传授啊。
4楼2022-02-06 17:42:15
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