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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 琼脂糖凝胶电泳：同一批样每次结果不一致，为什么?_?
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wardwaads

银虫 (小有名气)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳：同一批样每次结果不一致，为什么?_? 已有2人参与

请大家帮我分析一下下面这三张图：
这三张图都是同一批PCR产物的，目的条带大小为400多bp，其中 图4.21 是pcr结束后立即跑的；图new1 图new2 分别是隔夜后第2，3次跑的。

我自己有以下几个疑惑：
1.图4.21 中为什么目的条带是月牙形的？胶上背景不均我认为可能和没有冲洗彻底有关，或者是制胶问题？
2.图new1 同一批样品为什么完全没有显示条带？marker是有的。
3.图new2 再次跑了之后发现又有了条带，但是参差不齐，而且大部分目的条带不在400bp了，不知道是为什么？
4.另外空白样中出现了目的条带，我不认为我操作中出现了交叉污染。可能是什么原因导致呢？


另外需要说明的是，我的这些条带是通过两步法PCR做出的。即：第一次PCR后取产物加入新的体系中进行第二次PCR，然后来跑胶。因为第一次PCR产物跑胶一直跑不出来，所以我认为是由于我的模板含量在我的样本中的含量过低。

请大家帮我分析分析，谢谢～

琼脂糖凝胶电泳：同一批样每次结果不一致，为什么?_?
new1.jpg


琼脂糖凝胶电泳：同一批样每次结果不一致，为什么?_?-1
new2.jpg


琼脂糖凝胶电泳：同一批样每次结果不一致，为什么?_?-2
4.21.jpg
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1楼 2014-04-24 00:03:47
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定后目的条带位置？你的Marker没标错吧最低多少？
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学习使你立于不败之地
2楼2014-04-24 10:44:00
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wardwaads

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-04-24 10:44:00
确定后目的条带位置？你的Marker没标错吧最低多少？

DL500，分别是：500，400，300，200，150，100，50
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3楼2014-04-25 09:49:20
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jonew

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
月牙形说明你胶浓度小   另外小孔胶有时候就这样
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借口很贱，，，
4楼2014-04-25 10:20:52
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wardwaads

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jonew at 2014-04-25 10:20:52
月牙形说明你胶浓度小   另外小孔胶有时候就这样

谢谢你！
浓度应该是不大。
我用的大孔的梳子制胶，上样量为10uL.
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5楼2014-04-27 09:52:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽)

2013年9月24日

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
I.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。
II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。
III.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：
     1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决：
（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
（4）重新提取模板DNA。
    2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。
IV.考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。
V.调整变性和退火温度时间。
VI.更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。
VII.适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
VIII.Taq酶的专一性扩增不够。往往一些来源的DNA聚合酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策：改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
    酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
IX.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
X.适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。
一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。Mg2+ 浓度与dNTP的浓度一般同方向偶联调节。
XI.适当减少退货时间和提高退火温度。
XII.在反应体系中加入：1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率。
过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年8月14日重新编辑核对的。
XIII.使用巢式PCR。
    调整镁离子浓度时，可以与dNTP正相关的梯度调整，两者同方向分梯度调节，一般不要反方向调节；但是可以单独镁离子浓度，而dNTP浓度不动；有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增，或者有时候就是可以不动dNTP浓度而只调节镁离子浓度也能够增加PCR的专一性。
     我参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669
过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，有的文献与yujitianqing的帖子的内容基本上一致，也有些文献与yujitianqing的帖子的内容不一致。

具体是那种情况，我们可以在具体从各种可能性中选择，或者在在根据具体情况添加因素，目前我只能想到这些。
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6楼2014-04-27 10:07:56
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wardwaads

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-04-27 10:07:56
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽)

2013年9月24日

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
I.引物与靶序 ...

谢谢你！
我的这个循环次数是比较多，经过了2次PCR，每次有35个循环。只是不知道这结果出现的条带位置不对的话，还是不是目的条带？还是出现了其他的非特异性扩增。这一点我准备拿去测序。

另外为什么同一批结果不同电泳成图都不一样呢，这一点我很奇怪。
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7楼2014-04-28 09:40:13
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笑西少

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

对于月牙形状的条带，我感觉应该是胶孔的问题，拔梳子的时候很可能会产生胶孔不均匀。我的经验是，在拔梳子前，把一部分电解液冲到胶孔上。因为梳子是疏水材料做的，所以加上电解液，会比较容易拔出来梳子，胶孔形状也比较好。对于图new1和new2，我还真的没有遇到过类似情况。愿LZ实验顺利！

P.S.我也是刚刚开始PCR和跑胶的，经验多有不足，如果表达有误，见谅见谅。
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天然产物化学
8楼2014-06-12 19:14:18
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笑西少

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wardwaads at 2014-04-28 09:40:13
谢谢你！
我的这个循环次数是比较多，经过了2次PCR，每次有35个循环。只是不知道这结果出现的条带位置不对的话，还是不是目的条带？还是出现了其他的非特异性扩增。这一点我准备拿去测序。

另外为什么同一批结 ...

对于同一批次结果不同电泳成图不一样，不知道是不是制胶的问题。两次制的胶会不会不是很一致？
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天然产物化学
9楼2014-06-12 19:15:56
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Rechellijuan

新虫 (小有名气)
我的是空白也能跑出条带，不过我也是第一次做，我在加那个MIX时同一批次没有换枪头，无菌水时同一批次没有换枪头，加引物的同一批次也没有换枪头，但是我加模板时一个一换的 ，但是空白还是有条带，我做了好好多种水对比了下  空白还是有条带。
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10楼2015-04-19 17:35:06
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