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预防凯凯

新虫 (初入文坛)

[求助] Red同源重组 已有2人参与

我用Red同源重组的方法缺失沙门氏菌的氟苯尼考耐药基因floR，但是在转pKD4的时候老是打靶不进去，这是为什么？我的打靶引物是50bp的同源臂+20bp的卡那霉素的抗性基因引物，这跟floR基因有关吗？ 这个基因是质粒上有染色体上也有？ 有高手吗，求助啊
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1楼 2014-03-24 20:25:07
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yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)
我最开始做的时候也总是做不出来不，但有几点你得注意：
   1. 电转的条件，包括电压和时间；
   2. 敲入片段的浓度，尽量浓一些；
此外，板上的抗性你可以少加一些，我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的菌种不同，所以以上意见仅供参考。
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2楼2014-03-26 19:02:00
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
虽然Red的理论重组臂在50bp就满足了，但还是设长点比较好，加长重组臂在200bp。
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3楼2014-03-27 10:28:43
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixibiyu at 2014-03-26 19:02:00
我最开始做的时候也总是做不出来不，但有几点你得注意：
   1. 电转的条件，包括电压和时间；
   2. 敲入片段的浓度，尽量浓一些；
此外，板上的抗性你可以少加一些，我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的 ...

嗯，好的，谢谢，我的是2000V，5ms，打靶片段浓度为200-400ng/uL，感觉挺高了啊
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4楼2014-03-27 22:06:03
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-03-27 10:28:43
虽然Red的理论重组臂在50bp就满足了，但还是设长点比较好，加长重组臂在200bp。

嗯，我试着增长打靶片段的同源臂的长度试一下，真的是只要做出来，我就很感谢了
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5楼2014-03-27 22:07:14
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yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 预防凯凯 at 2014-03-27 22:06:03
嗯，好的，谢谢，我的是2000V，5ms，打靶片段浓度为200-400ng/uL，感觉挺高了啊...

那楼主试试加长同源臂的长度吧，我一般是45bp。楼主知道沙门氏菌从哪可以弄到吗？我想从它的基因组里扩增一个基因。
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6楼2014-03-28 13:32:18
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yixibiyu at 2014-03-28 13:32:18
那楼主试试加长同源臂的长度吧，我一般是45bp。楼主知道沙门氏菌从哪可以弄到吗？我想从它的基因组里扩增一个基因。...

我们的沙门氏菌是在兽医院临床分离到的，如果你想要的话，可以去那边看看，或者可以到当地的疾病控制中心看看，应该也能分离到，或者在微生物保种中心应该也会有沙门氏菌的标准株的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-03-29 23:50:30
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
我用RED重组敲除副溶血弧菌的基因,用的是pkd46和pkd3,楼主用pkd46了吗?
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8楼2014-03-31 21:18:44
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2014-03-31 21:18:44
我用RED重组敲除副溶血弧菌的基因,用的是pkd46和pkd3,楼主用pkd46了吗?

用了啊，先转进pKD46，然后用L阿拉伯糖诱导的，不过现在已经做出一株了，但是不知道怎么算缺失的长度，关键不知道卡那霉素的抗性基因是多大，哎
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9楼2014-04-07 22:11:28
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日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 预防凯凯 at 2014-04-07 22:11:28
用了啊，先转进pKD46，然后用L阿拉伯糖诱导的，不过现在已经做出一株了，但是不知道怎么算缺失的长度，关键不知道卡那霉素的抗性基因是多大，哎...

最近我也在做Red敲除，是假单胞菌的，用pRKaraRed代替pKD46，可是我目前只有氨苄抗性打靶片段，但做了才发现假单胞菌抗氨苄，但不抗卡那霉素。楼主pKD4是否有多的？能否送我一点，或者我手上有的质粒交换也可以。
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周老湿
10楼2015-05-25 09:36:49
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