应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » Red同源重组
111/2返回列表12下一页
查看: 3657  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

预防凯凯

新虫 (初入文坛)

[求助] Red同源重组 已有2人参与

我用Red同源重组的方法缺失沙门氏菌的氟苯尼考耐药基因floR，但是在转pKD4的时候老是打靶不进去，这是为什么？我的打靶引物是50bp的同源臂+20bp的卡那霉素的抗性基因引物，这跟floR基因有关吗？ 这个基因是质粒上有染色体上也有？ 有高手吗，求助啊
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-24 20:25:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)
我最开始做的时候也总是做不出来不，但有几点你得注意：
   1. 电转的条件，包括电压和时间；
   2. 敲入片段的浓度，尽量浓一些；
此外，板上的抗性你可以少加一些，我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的菌种不同，所以以上意见仅供参考。
赞一下 回复此楼
2楼2014-03-26 19:02:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
虽然Red的理论重组臂在50bp就满足了，但还是设长点比较好，加长重组臂在200bp。
赞一下 回复此楼
3楼2014-03-27 10:28:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixibiyu at 2014-03-26 19:02:00
我最开始做的时候也总是做不出来不，但有几点你得注意：
   1. 电转的条件，包括电压和时间；
   2. 敲入片段的浓度，尽量浓一些；
此外，板上的抗性你可以少加一些，我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的 ...

嗯，好的，谢谢，我的是2000V，5ms，打靶片段浓度为200-400ng/uL，感觉挺高了啊
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-27 22:06:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-03-27 10:28:43
虽然Red的理论重组臂在50bp就满足了，但还是设长点比较好，加长重组臂在200bp。

嗯，我试着增长打靶片段的同源臂的长度试一下，真的是只要做出来，我就很感谢了
赞一下 回复此楼
5楼2014-03-27 22:07:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 预防凯凯 at 2014-03-27 22:06:03
嗯，好的，谢谢，我的是2000V，5ms，打靶片段浓度为200-400ng/uL，感觉挺高了啊...

那楼主试试加长同源臂的长度吧，我一般是45bp。楼主知道沙门氏菌从哪可以弄到吗？我想从它的基因组里扩增一个基因。
赞一下 回复此楼
6楼2014-03-28 13:32:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yixibiyu at 2014-03-28 13:32:18
那楼主试试加长同源臂的长度吧，我一般是45bp。楼主知道沙门氏菌从哪可以弄到吗？我想从它的基因组里扩增一个基因。...

我们的沙门氏菌是在兽医院临床分离到的，如果你想要的话，可以去那边看看，或者可以到当地的疾病控制中心看看，应该也能分离到，或者在微生物保种中心应该也会有沙门氏菌的标准株的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
7楼2014-03-29 23:50:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
我用RED重组敲除副溶血弧菌的基因,用的是pkd46和pkd3,楼主用pkd46了吗?
赞一下 回复此楼
8楼2014-03-31 21:18:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2014-03-31 21:18:44
我用RED重组敲除副溶血弧菌的基因,用的是pkd46和pkd3,楼主用pkd46了吗?

用了啊，先转进pKD46，然后用L阿拉伯糖诱导的，不过现在已经做出一株了，但是不知道怎么算缺失的长度，关键不知道卡那霉素的抗性基因是多大，哎
赞一下 回复此楼
9楼2014-04-07 22:11:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

日光海

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 预防凯凯 at 2014-04-07 22:11:28
用了啊，先转进pKD46，然后用L阿拉伯糖诱导的，不过现在已经做出一株了，但是不知道怎么算缺失的长度，关键不知道卡那霉素的抗性基因是多大，哎...

最近我也在做Red敲除，是假单胞菌的，用pRKaraRed代替pKD46，可是我目前只有氨苄抗性打靶片段，但做了才发现假单胞菌抗氨苄，但不抗卡那霉素。楼主pKD4是否有多的？能否送我一点，或者我手上有的质粒交换也可以。
赞一下 回复此楼
周老湿
10楼2015-05-25 09:36:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 预防凯凯 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +11 医学老男孩 2026-08-13 29/1450 2026-08-14 00:04 by 大快人心啦
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +3 启萌科技 2026-08-12 11/550 2026-08-13 22:57 by 启萌科技
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 28/1400 2026-08-13 17:51 by 医学老男孩
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +4 majunge000 2026-08-11 6/300 2026-08-13 16:50 by 四季常青藤
[基金申请] filecode +14 documentary 2026-08-10 16/800 2026-08-13 16:39 by 润生71
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] 好奇怪的filecode +5 布布和一二 2026-08-08 6/300 2026-08-12 16:11 by 云上清扬
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭