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预防凯凯

新虫 (初入文坛)

[求助] Red同源重组 已有2人参与

我用Red同源重组的方法缺失沙门氏菌的氟苯尼考耐药基因floR,但是在转pKD4的时候老是打靶不进去,这是为什么?我的打靶引物是50bp的同源臂+20bp的卡那霉素的抗性基因引物,这跟floR基因有关吗? 这个基因是质粒上有染色体上也有? 有高手吗,求助啊
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日光海

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 预防凯凯 at 2014-04-07 22:11:28
用了啊,先转进pKD46,然后用L阿拉伯糖诱导的,不过现在已经做出一株了,但是不知道怎么算缺失的长度,关键不知道卡那霉素的抗性基因是多大,哎...

最近我也在做Red敲除,是假单胞菌的,用pRKaraRed代替pKD46,可是我目前只有氨苄抗性打靶片段,但做了才发现假单胞菌抗氨苄,但不抗卡那霉素。楼主pKD4是否有多的?能否送我一点,或者我手上有的质粒交换也可以。
周老湿
10楼2015-05-25 09:36:49
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yixibiyu

铁杆木虫 (正式写手)

我最开始做的时候也总是做不出来不,但有几点你得注意:
   1. 电转的条件,包括电压和时间;
   2. 敲入片段的浓度,尽量浓一些;
此外,板上的抗性你可以少加一些,我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的菌种不同,所以以上意见仅供参考。
2楼2014-03-26 19:02:00
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
虽然Red的理论重组臂在50bp就满足了,但还是设长点比较好,加长重组臂在200bp。
3楼2014-03-27 10:28:43
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yixibiyu at 2014-03-26 19:02:00
我最开始做的时候也总是做不出来不,但有几点你得注意:
   1. 电转的条件,包括电压和时间;
   2. 敲入片段的浓度,尽量浓一些;
此外,板上的抗性你可以少加一些,我当时用的是25ug/ml的量。

因为我们做的 ...

嗯,好的,谢谢,我的是2000V,5ms,打靶片段浓度为200-400ng/uL,感觉挺高了啊
4楼2014-03-27 22:06:03
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