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答案24

木虫 (初入文坛)

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[求助] 荧光半定量实验,望大师援助. 已有1人参与

我正在做荧光半定量实验,后面三个是孔是内参基因的结果,前面三个孔是目的基因的结果.内参基因的条带还行,为什么目的基因的条带会出现这样的结果(模带).求大师解释一下,并提出改进办法.谢谢

2014-01-13 14.03.09.jpg

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认真仔细乐观的对待每一天

1楼 2014-02-27 16:08:47

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新人小玥

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+6, 鼓励回帖交流！ 2014-02-27 18:29:14
答案24(西门吹雪170代发): 金币+10, 有帮助 2014-03-01 16:04:40

我想问问您这是照的不行还是怎么的？
个人认为您需要改进的地方还挺多的：
首先照片比较模糊，您看能不能调到一个比较清楚的焦距再拍照。
再来您所用的marker是多少的？个人觉得您所用的应该是marker III类似的marker。看条带觉得没怎么跑开。建议将胶的浓度调高点，用1.5%~2%的胶能跑出质量较高的条带，尤其的2%的。
接着，看内参里也有其它模糊条带出现。这可能是PCR本身有污染，或者内参选择不够特异，或者是做胶没做好。胶需要充分溶解后，冷却到不烫手时再加EB。这个要特别小心
最后，说说您的目的基因，从图上来看，可能是由于所选基因不够特异，拖尾现象严重。还有可能是PCR存在污染，还有就是胶的问题。
我建议您先做一块质量较高的胶，PCR加样尽量避免污染（换掉以前用的所有buffer等，尤其是水）。先保证内参的条带是特异性的，再来看您的目的基因情况，如果还有这么严重的拖尾现象，不如重新设计引物吧。。。。

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2楼2014-02-27 17:32:34

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