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Prad gen(0.23kb)克隆做不出来
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Prad cloning, 我做了三遍都没做做出来， 大神们能不能帮我指导一下， 万分感谢 Prad gene0.24kb, 1. I designed 5' primer(BamH site and Kozak sequence), 3' primer(, Xbal site and three stop codon) use NEB fushion polymerase to do pcr, follow the protocol and caculate the annealing T, then run the gel, ues 1kb ladder, find the band in the front, which indicates the pretty short band, namely prad gene. One problem is I loaded three lanes in the gel(I had three 25ul samples, didn't master mix), when I cut the gel, the 1st lane is pretty bright, while the other two lanes are shadow. They came from one pcr product, the brightness should be the same, while I didin't master mix them. So then I didi gel exaction the concentration is 18.9ng/ul, a bit low. 2 I use Pef6/V5 vector, use Bamh and Xbal to digest the Vector and prad Insert individually, use NEB curt smart buffer. Run the gel again, use 1kb ladder, for prad insert, the band is at the bottom, and for vector the band is a little higher than 5kb band. So this means I indeed cut the vecotr and insert. 3 I did PCR purification for insert and Gel extraction for vector, test the concentrations, Insert 10.1ng/ul, Vector 29.9ng/ul, Then I did ligation using Neb ligation enzyme. Then run the gel for analysis, I found the ligaiton band is almost the same as the vector band, because prad is very short-0.23kb, so 做完ligation后，跑胶，根本看不出plasmid有还是没有。 4，I did transformation, prepared two LB-agar plates, one loaded 20ulecoli+180LB medium, One loaded 180ecoli, 37oC for 16hrs, then put the 4oC fridge for 24hrs, to let insert degrade, 如果不这样做， 直接做cloning pcr, 跑出来的band都会和 template prad DNA的一样， 但其实是insert， 不是真的在ecoli中表达了。4度冰一天后， 拿出来做cloning pcr, 跑胶， 20个样， 有两个亮度只有template的一般， 其他的就基本看不到了。 学长说要取和Template带一样亮的， 我的没有哈， 就说没有转进去。 我做三遍了， cloning pcr跑完的带都像这样， 简而言之， 亮度达不到， 您能帮我看看是哪里有问题或该怎么改进吗？因为有个bioforum我也问了， 所以有些英文还有点长， 耽误你的时间了，万分感谢。 |
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