24小时热门版块排行榜

返回列表

wanglavender

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 116.5
帖子: 9
在线: 7.5小时
虫号: 2554512
注册: 2013-07-19
专业: 蛋白质组学

[求助] Prad gen(0.23kb)克隆做不出来

Prad cloning, 我做了三遍都没做做出来，大神们能不能帮我指导一下，万分感谢
Prad gene0.24kb,
1. I designed 5' primer(BamH site and Kozak sequence), 3' primer(, Xbal site and three stop codon)
use NEB fushion polymerase to do pcr, follow the protocol and caculate the annealing T, then run the gel, ues 1kb ladder, find the band in the front, which indicates the pretty short band, namely prad gene. One problem is I loaded three lanes in the gel(I had three 25ul samples, didn't master mix), when I cut the gel, the 1st lane is pretty bright, while the other two lanes are shadow. They came from one pcr product, the brightness should be the same, while I didin't master mix them. So then I didi gel exaction the concentration is 18.9ng/ul, a bit low.
2 I use Pef6/V5 vector, use Bamh and Xbal to digest the Vector and prad Insert individually, use NEB curt smart buffer. Run the gel again, use 1kb ladder, for prad insert, the band is at the bottom, and for vector the band is a little higher than 5kb band. So this means I indeed cut the vecotr and insert.
3 I did PCR purification for insert and Gel extraction for vector, test the concentrations, Insert 10.1ng/ul, Vector 29.9ng/ul, Then I did ligation using Neb ligation enzyme. Then run the gel for analysis, I found the ligaiton band is almost the same as the vector band, because prad is very short-0.23kb, so 做完ligation后，跑胶，根本看不出plasmid有还是没有。
4，I did transformation, prepared two LB-agar plates, one loaded 20ulecoli+180LB medium, One loaded 180ecoli, 37oC for 16hrs, then put the 4oC fridge for 24hrs, to let insert degrade, 如果不这样做，直接做cloning pcr, 跑出来的band都会和 template prad DNA的一样，但其实是insert，不是真的在ecoli中表达了。4度冰一天后，拿出来做cloning pcr, 跑胶， 20个样，有两个亮度只有template的一般，其他的就基本看不到了。学长说要取和Template带一样亮的，我的没有哈，就说没有转进去。我做三遍了， cloning pcr跑完的带都像这样，简而言之，亮度达不到，您能帮我看看是哪里有问题或该怎么改进吗？因为有个bioforum我也问了，所以有些英文还有点长，耽误你的时间了，万分感谢。

回复此楼

» 猜你喜欢

1楼 2014-02-20 09:52:44

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~

PCR产物纯化后，再做模版什么东西都扩不出来为什么呀？已经有3人回复
T载体克隆做不出来，求帮助已经有24人回复
T-A克隆一直做不出来已经有28人回复
PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？已经有13人回复
核酸内切酶和核酸外切酶已经有4人回复
目的基因的连接与转化已经有3人回复
PEG处理实验材料已经有6人回复
求助：亚克隆做不出来已经有5人回复
求解：末端补平原理已经有3人回复
平末端连接做不出来克隆已经有30人回复
简单的反应为什么做不出来，如何用苯肼盐酸盐和苯乙酮合成苯乙酮苯腙已经有18人回复
overlap PCR做不出来呐。。。。已经有23人回复
做过用同源重组进行基因敲出的朋友请进，PCR做不出来！！已经有16人回复
T载体连接目的片段后做蓝白斑全都是假阳性已经有6人回复
请教各位前辈为什么我做菌落PCR总也P不出来已经有28人回复
TA克隆遇到的问题已经有10人回复
【求助】我为什么做这个迈克尔加成反应做不出来呢已经有9人回复
【求助/交流】WB老做不出来已经有6人回复
【求助/交流】芽孢染色做不出来，望高人指点已经有21人回复
【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办已经有74人回复
【求助/交流】vector 已经有10人回复

点击这里搜索更多相关资源

科研从小木虫开始，人人为我，我为人人

相关版块跳转我要订阅楼主 wanglavender 的主题更新

返回列表