应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 求助酶的镍柱纯化
51/1返回列表
查看: 1892  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

wzp9012

铁虫 (著名写手)

[求助] 求助酶的镍柱纯化 已有3人参与

小弟最近在做酶学性质，但一直卡在镍柱纯化这一块，先前是蛋白挂不上去，听各位师兄师姐的建议调低咪挫之后，蛋白挂上去了，后来用咪挫洗，跑电泳，除目的蛋白外还有少量的杂蛋白，最近一次跑交发现里面杂蛋白好多，简直就是原蛋白稀释后的，完全没有纯化出来。想请教师兄师姐，纯化出来的只有目的蛋白的一条带的是怎么弄得，谢谢。（小弟先前是这样的，上样：1mmol/l，平衡液10mmol/l，洗脱500mmol/l）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-01-16 22:23:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biology-girl

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Allen206 at 2014-01-17 15:29:42
上样缓冲液里面不能有咪唑，洗脱的时候拉一个长梯度，然后透析，过离子柱子，减少非特异性吸附就那些办法，木虫里面有资料，加入去污剂，盐浓度，甘油，没别的了，

上样缓冲液里 不能有咪唑？ 没有咪唑不是挂不上镍柱吗？
赞一下 回复此楼
9楼2014-06-16 09:41:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:27
我一般用的咪挫是equilibration 5mM, wash 20 mM, elution 250 mM. 我假定你说的平衡液就是指wash buffer
你这个浓度应该没问题，但是不仅仅是浓度，还有你一般用多少体积来。如果洗的体积过多，蛋白就都洗没了；洗的体积太少，还有杂质。对于10ml的镍柱，我一般不会用超过50ml wash buffer.
实在纯化不出来就用钴柱吧，比镍柱贵，但是特异性好很多
赞一下 回复此楼
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2014-01-16 23:39:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

heylixing

铁虫 (正式写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:31
买点氯化钴，把镍脱下来，换成钴。我觉得这个蛋白可以过其他柱，干嘛非要过镍柱，有时候镍柱就这种纯化效果。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-01-16 23:54:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Allen206

银虫 (小有名气)
什么系统出来的蛋白？埃希氏么？有没有标签，序列性质都知道么？
赞一下 回复此楼
不想说什么，，，，
4楼2014-01-17 12:53:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭