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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 求助酶的镍柱纯化
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wzp9012

铁虫 (著名写手)

[求助] 求助酶的镍柱纯化 已有3人参与

小弟最近在做酶学性质，但一直卡在镍柱纯化这一块，先前是蛋白挂不上去，听各位师兄师姐的建议调低咪挫之后，蛋白挂上去了，后来用咪挫洗，跑电泳，除目的蛋白外还有少量的杂蛋白，最近一次跑交发现里面杂蛋白好多，简直就是原蛋白稀释后的，完全没有纯化出来。想请教师兄师姐，纯化出来的只有目的蛋白的一条带的是怎么弄得，谢谢。（小弟先前是这样的，上样：1mmol/l，平衡液10mmol/l，洗脱500mmol/l）
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1楼 2014-01-16 22:23:54
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:27
我一般用的咪挫是equilibration 5mM, wash 20 mM, elution 250 mM. 我假定你说的平衡液就是指wash buffer
你这个浓度应该没问题，但是不仅仅是浓度，还有你一般用多少体积来。如果洗的体积过多，蛋白就都洗没了；洗的体积太少，还有杂质。对于10ml的镍柱，我一般不会用超过50ml wash buffer.
实在纯化不出来就用钴柱吧，比镍柱贵，但是特异性好很多
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2014-01-16 23:39:35
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heylixing

铁虫 (正式写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:31
买点氯化钴，把镍脱下来，换成钴。我觉得这个蛋白可以过其他柱，干嘛非要过镍柱，有时候镍柱就这种纯化效果。
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3楼2014-01-16 23:54:19
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Allen206

银虫 (小有名气)
什么系统出来的蛋白？埃希氏么？有没有标签，序列性质都知道么？
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不想说什么，，，，
4楼2014-01-17 12:53:56
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wzp9012

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-01-16 23:39:35
我一般用的咪挫是equilibration 5mM, wash 20 mM, elution 250 mM. 我假定你说的平衡液就是指wash buffer
你这个浓度应该没问题，但是不仅仅是浓度，还有你一般用多少体积来。如果洗的体积过多，蛋白就都洗没了；洗 ...

因为粗酶量少，用的2ml的镍柱，用的15倍的洗杂，8倍洗脱，感觉杂的好像洗不掉，
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5楼2014-01-17 13:18:38
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wzp9012

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Allen206 at 2014-01-17 12:53:56
什么系统出来的蛋白？埃希氏么？有没有标签，序列性质都知道么？

恩，BL21，有六个组氨酸标记
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6楼2014-01-17 13:19:21
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wzp9012: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-17 20:59:47
上样缓冲液里面不能有咪唑，洗脱的时候拉一个长梯度，然后透析，过离子柱子，减少非特异性吸附就那些办法，木虫里面有资料，加入去污剂，盐浓度，甘油，没别的了，
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不想说什么，，，，
7楼2014-01-17 15:29:42
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acvhreinlg

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
上样前先用500mM的洗下柱子，再用10 mM洗个几个柱体积平衡柱子，我一般上样是10mM，washbuffer是50mM的洗5个柱体积，再少量elution500mM

[ 发自小木虫客户端 ]
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科研是将金钱转换为知识的过程，而创新则是将知识转换为金钱的过程。
8楼2014-01-17 15:56:34
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biology-girl

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Allen206 at 2014-01-17 15:29:42
上样缓冲液里面不能有咪唑，洗脱的时候拉一个长梯度，然后透析，过离子柱子，减少非特异性吸附就那些办法，木虫里面有资料，加入去污剂，盐浓度，甘油，没别的了，

上样缓冲液里 不能有咪唑？ 没有咪唑不是挂不上镍柱吗？
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9楼2014-06-16 09:41:12
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