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wzp9012

铁虫 (著名写手)

[求助] 求助酶的镍柱纯化 已有3人参与

小弟最近在做酶学性质,但一直卡在镍柱纯化这一块,先前是蛋白挂不上去,听各位师兄师姐的建议调低咪挫之后,蛋白挂上去了,后来用咪挫洗,跑电泳,除目的蛋白外还有少量的杂蛋白,最近一次跑交发现里面杂蛋白好多,简直就是原蛋白稀释后的,完全没有纯化出来。想请教师兄师姐,纯化出来的只有目的蛋白的一条带的是怎么弄得,谢谢。(小弟先前是这样的,上样:1mmol/l,平衡液10mmol/l,洗脱500mmol/l)
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wzp9012: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-17 20:59:47
上样缓冲液里面不能有咪唑,洗脱的时候拉一个长梯度,然后透析,过离子柱子,减少非特异性吸附就那些办法,木虫里面有资料,加入去污剂,盐浓度,甘油,没别的了,
不想说什么,,,,
7楼2014-01-17 15:29:42
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:27
我一般用的咪挫是equilibration 5mM, wash 20 mM, elution 250 mM. 我假定你说的平衡液就是指wash buffer
你这个浓度应该没问题,但是不仅仅是浓度,还有你一般用多少体积来。如果洗的体积过多,蛋白就都洗没了;洗的体积太少,还有杂质。对于10ml的镍柱,我一般不会用超过50ml wash buffer.
实在纯化不出来就用钴柱吧,比镍柱贵,但是特异性好很多
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2014-01-16 23:39:35
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heylixing

铁虫 (正式写手)

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-17 12:49:31
买点氯化钴,把镍脱下来,换成钴。我觉得这个蛋白可以过其他柱,干嘛非要过镍柱,有时候镍柱就这种纯化效果。
3楼2014-01-16 23:54:19
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Allen206

银虫 (小有名气)

什么系统出来的蛋白?埃希氏么?有没有标签,序列性质都知道么?
不想说什么,,,,
4楼2014-01-17 12:53:56
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