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libinaizuqiu

新虫 (初入文坛)

[求助] 自杀载体问题已有2人参与

自杀载体通过同源臂与基因组发生同源重组从而整合在基因组上,我想请问是整个质粒都整合上去了吗?如果是的话,整合的位置在哪?是不是只破坏了目的基因,会不会影响基因组上其他基因的表达?
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-12 16:24:40
如果你做的是双交换同源重组,只有同源臂之间的序列整合到染色体上了。如果你只设计一段同源序列,即单交换,这个质粒都会整合到染色体上。整合的位置是你设计的同源序列的位置。是否影响基因组其他基因的表达,需要实验证明。因为有些基因的编码区可能存在对其他基因的调控元件。
2楼2014-01-12 11:15:57
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libinaizuqiu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-12 11:15:57
如果你做的是双交换同源重组,只有同源臂之间的序列整合到染色体上了。如果你只设计一段同源序列,即单交换,这个质粒都会整合到染色体上。整合的位置是你设计的同源序列的位置。是否影响基因组其他基因的表达,需要 ...

只有同源臂之间的序列整合到染色体上了是什么意思?我质粒上的同源臂是目的基因的上臂和下臂,即两个同源臂连到质粒上
3楼2014-01-12 12:33:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by libinaizuqiu at 2014-01-12 12:33:15
只有同源臂之间的序列整合到染色体上了是什么意思?我质粒上的同源臂是目的基因的上臂和下臂,即两个同源臂连到质粒上...

有什么疑问吗?只有同源臂之间的序列会整合到染色体,通过同源重组。
4楼2014-01-12 17:14:27
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-13 10:37:31
gyesang: 回帖置顶 2014-01-13 16:56:32
按lz实验,应该是同源臂和质粒都整合到基因组上,需要经过二次重组筛选(依质粒特性,如SacB基因或温敏原件)使自杀质粒丢失,再经过验证后获得突变体。

看个示意图:http://pan.baidu.com/s/1mgBIOA0
做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2014-01-13 08:29:54
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libinaizuqiu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-01-13 08:29:54
按lz实验,应该是同源臂和质粒都整合到基因组上,需要经过二次重组筛选(依质粒特性,如SacB基因或温敏原件)使自杀质粒丢失,再经过验证后获得突变体。

看个示意图:http://pan.baidu.com/s/1mgBIOA0

太感谢了,我用的就是这个原理,不过我做了几次二次重组了,得到的全是野生型,我想请问你们二次重组得到突变体的效率高吗?
6楼2014-01-13 16:15:11
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by libinaizuqiu at 2014-01-13 16:15:11
太感谢了,我用的就是这个原理,不过我做了几次二次重组了,得到的全是野生型,我想请问你们二次重组得到突变体的效率高吗?...

一般我随机选4个单菌落,会有1-2个是突变体;全是野生型的只遇到过一次。
做一个阳光、开朗的小和尚
7楼2014-01-14 09:16:09
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libinaizuqiu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-01-14 09:16:09
一般我随机选4个单菌落,会有1-2个是突变体;全是野生型的只遇到过一次。...

你们的效率真高,我们这个菌太难做了,前一步载体导入受体菌,你们用的三亲结合还是电机转化?
8楼2014-01-14 09:37:24
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by libinaizuqiu at 2014-01-14 09:37:24
你们的效率真高,我们这个菌太难做了,前一步载体导入受体菌,你们用的三亲结合还是电机转化?...

双亲接合,E. coli S17-1 λpir
做一个阳光、开朗的小和尚
9楼2014-01-14 14:15:45
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libinaizuqiu

新虫 (初入文坛)

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9楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-01-14 14:15:45
双亲接合,E. coli S17-1 λpir...

E. coli S17-1 λpir  是什么?求教
10楼2014-01-14 15:40:22
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