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zdb123

银虫 (初入文坛)

[求助] 原生质体制备时如何过滤酶液,如何收集原生质体 已有2人参与

最近在做大麦糊粉层的原生质体,遇到了很多的麻烦:
        首先纤维素酶不溶解,用了CPW缓冲液,乙酸 缓冲液等等都不行;
        第二,制备不了球形的原生质体,在显微镜观察都是絮状的;
        第三,不知道怎么过滤掉酶液;
        第四,如何收集原生质体,我按照一些文献上方法,在10目的尼龙网上过滤,然后在用洗涤液在尼龙网上冲洗,收集细胞,我发现这过程中,收集率很低,而且原生质体的密度液非常低。
     还望各位大神不惜赐教,由衷的万分感激。
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知行合一
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十比

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-17 09:55:51
zdb123: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-19 08:14:50
zdb123: 金币+5 2013-12-19 08:15:14
酶液在55度左右加热10分钟,然后用转子转几下很快会溶,收集用50-100um小孔的的小滤网(BD公司)过滤就行。你可以看看Jean Sheen的网站,上面有做拟南芥原生质的详细信息。
2楼2013-12-17 05:04:24
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lzhwin

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zdb123: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-19 08:15:01
引用回帖:
2楼: Originally posted by 十比 at 2013-12-17 05:04:24
酶液在55度左右加热10分钟,然后用转子转几下很快会溶,收集用50-100um小孔的的小滤网(BD公司)过滤就行。你可以看看Jean Sheen的网站,上面有做拟南芥原生质的详细信息。

补充一下:纤维素酶在PH5.7的MES溶液里转子搅拌几分钟就可以溶解,这个时候是浑浊的,55度水浴10分钟后会变得澄清,酶液要用0.22微米的针头滤器过滤一下否则制备出来的原生质体容易涨菌。

最后:楼上是我们实验室老大,老大威武!
3楼2013-12-17 11:18:31
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