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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 原生质体制备 溶菌酶配制 P缓冲溶液
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yghboy168

银虫 (小有名气)

[求助] 原生质体制备 溶菌酶配制 P缓冲溶液 已有2人参与

我现在打算做原生质体制备和融合，不知道固体的溶菌酶用什么缓冲溶液比较好，最适的PH?,还有文献里提到P缓冲溶液，不知道组分是什么？希望帮忙！多谢！
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Streptomyces Bar

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眼内有尘三界窄，心头无事一床宽！
1楼 2012-10-21 11:42:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

电电的开始

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+3, 鼓励新虫发帖 2012-10-21 17:43:16
（一）缓冲液
（1）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0），100ml
磷酸二氢钾1.5g       磷酸氢二钾3.5g
（2）高渗缓冲液（10ml）；于上述缓冲液中加入0.8 mol/L甘露醇
（3）0.9%生理盐水100ml
7x4.5ml+5x4.5ml，其余装入三角瓶灭菌
（二）原生质体稳定液（SMM）100ml
0.5 mol/L蔗糖、20 mol/L MgCl2、0.02 mol/L顺丁烯二酸，调pH6.5
5x4.5ml，其余装入三角瓶灭菌
（三）溶菌酶液
用SMM溶液配制，终浓度为1mg/ml,过滤除菌备用。
我用的菌株是：枯草芽孢杆菌株
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为自己而开始
3楼2012-10-21 16:11:41
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普通回帖

lgs1

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-21 17:42:58
你可以看看这篇文献Bacterial  Protoplast  Fusion:  Recombination  in Fused  Protoplasts of Streptomyces coelicolor，里面有P溶液的配方，链接是http://good.gd/2264083.htm
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2楼2012-10-21 15:22:18
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yc652090251

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-22 16:16:56
p缓冲液/L
（1）蔗糖  103g
        硫酸钾 0.25g
        氯化镁 2.02g
       微量元素 2ml 单独灭菌（）
      蒸馏水800ml
（2）磷酸二氢钾（0.5%） 1ml
        cacl2 （3.68%）    10ml
        TES  （5.73%，PH7.2）    10ml
每80（1）加入（2中）各1ml   10ml  10ml
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低调做人好么~~
4楼2012-10-22 09:42:25
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闫小贝

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
SMM：蔗糖171.5 g/L，MgCl2 4.273 g/L，顺丁烯二酸 2.336 g/L，双蒸水配制，pH 6.5，115℃灭菌30 min；
溶菌酶液：用SMM配制溶菌酶液,浓度为50 mg/mL
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5楼2012-10-23 10:29:27
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风雪夜夜

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 电电的开始 at 2012-10-21 16:11:41
（一）缓冲液
（1）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0），100ml
磷酸二氢钾1.5g       磷酸氢二钾3.5g
（2）高渗缓冲液（10ml）；于上述缓冲液中加入0.8 mol/L甘露醇
（3）0.9%生理盐水100ml
7x4.5ml+5x4.5ml，其余 ...

问你下，溶菌酶怎么使用啊？只能过滤除菌用吗？
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2016，我要和你在一起
6楼2014-08-30 20:16:37
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电电的开始

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 风雪夜夜 at 2014-08-30 20:16:37
问你下，溶菌酶怎么使用啊？只能过滤除菌用吗？...

离心弃上清液，加入新的SMM洗涤,制备悬浮的原生质体
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为自己而开始
7楼2014-09-01 10:10:05
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ccdbaobao

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 电电的开始 at 2012-10-21 16:11:41
（一）缓冲液
（1）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0），100ml
磷酸二氢钾1.5g       磷酸氢二钾3.5g
（2）高渗缓冲液（10ml）；于上述缓冲液中加入0.8 mol/L甘露醇
（3）0.9%生理盐水100ml
7x4.5ml+5x4.5ml，其余 ...

您好，我也在做枯草的原生质体制备，使用SMM作为高渗缓冲液的，但是再生时菌落数小于酶解后菌落数，重复多次都是如此，不知问题出在哪里。希望大神可以给与指导指导，跪谢啦啦啦。要是能看看你的整个实验流程和方案就好了，不知道可不可以给我发一份呢？谢谢谢谢啦
我邮箱：scvx433@163.com
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8楼2014-09-09 10:56:28
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电电的开始

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by ccdbaobao at 2014-09-09 10:56:28
您好，我也在做枯草的原生质体制备，使用SMM作为高渗缓冲液的，但是再生时菌落数小于酶解后菌落数，重复多次都是如此，不知问题出在哪里。希望大神可以给与指导指导，跪谢啦啦啦。要是能看看你的整个实验流程和方案 ...

再生时是不是使用高渗培养基呢？再生前有用SMM洗涤残留的溶菌酶，再用SMM制备悬浮液？还有一个是制备原生质体的菌是不是处于对数期的？
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为自己而开始
9楼2014-09-10 09:32:07
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ccdbaobao

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 电电的开始 at 2014-09-10 09:32:07
再生时是不是使用高渗培养基呢？再生前有用SMM洗涤残留的溶菌酶，再用SMM制备悬浮液？还有一个是制备原生质体的菌是不是处于对数期的？...

是用的高渗培养基，也有用SMM洗涤后再重悬，同样也是用的对数末期的菌体。。。现在我怀疑是高渗液的问题
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10楼2014-09-10 16:38:07
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