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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR单引物扩增问题
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三蛰

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR单引物扩增问题

小弟做了几个1kb左右的目的片段的扩增pcr，没想到结果是这样，一个博士跟我说这是单引物扩增，还有可能退火温度太低等等，不是很具体，想问问懂行的或者以前遇到过这种问题的大神们，怎么避免，如何改进？
PCR单引物扩增问题
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我不会！
1楼 2013-12-05 18:42:19
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-09 08:35:22
1.重新设计引物
2.提高退火温度
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借你一生好不好
2楼2013-12-05 21:36:47
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-12-05 21:36:47
1.重新设计引物
2.提高退火温度

嗯，我也这么想的，只是想问下，这种情况是什么原理。
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我不会！
3楼2013-12-06 00:29:43
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ninor

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-06 14:39:02
这种应该就是非特异性扩增,可能跟你的引物设计有关,专一性不是很强.想要避免非常困难,因为你不可能在做试验前就知道扩增的结果. 一般要改进的话,可以提高退火温度,降低模板浓度或者降低引物浓度.当然有些时候如果你的pcr buffer 有问题的话也会导致这种情况。如果反复设计引物都不成功的话，就要考虑是否是模板出问题了。
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4楼2013-12-06 01:29:04
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nancysea

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-09 08:35:28
PCR很复杂，什么模板？marker分别多大？那两天带大小都是什么？两条带中和你预期的如果有一个一样的话，可以先回收，做个TA克隆测序看看，不能一概而论！即使非特异带有，有时候也正常，不影响你的目的
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5楼2013-12-08 07:27:49
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nancysea at 2013-12-08 07:27:49
PCR很复杂，什么模板？marker分别多大？那两天带大小都是什么？两条带中和你预期的如果有一个一样的话，可以先回收，做个TA克隆测序看看，不能一概而论！即使非特异带有，有时候也正常，不影响你的目的

嘿嘿，这些我知道。我只是不想去切胶回收啥的……想用引物漂漂亮亮的扩增出目的片段，发文章好放图片…………
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我不会！
6楼2013-12-08 22:40:29
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nancysea

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

水平高点的文章用不上这种图，没用
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7楼2013-12-09 15:33:10
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古城十字路

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-08 22:40:29
嘿嘿，这些我知道。我只是不想去切胶回收啥的……想用引物漂漂亮亮的扩增出目的片段，发文章好放图片…………...

要真想用图，切胶回收连克隆转化测序，正确了直接用质粒扩。
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好好做实验。
8楼2014-05-13 15:57:44
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