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1楼2013-11-30 15:33:18

yuxiangdan

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【答案】应助回帖

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你扩增质粒上的序列不是你样品的基因吧？

[ 发自小木虫客户端 ]

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2楼2013-11-30 15:36:55

cicelyzh

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【答案】应助回帖

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Irus: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-12-19 18:47:54

说明产物不相同。核对一下序列差别和引物特异性。

3楼2013-12-01 02:41:44

Irus

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2楼: Originally posted by yuxiangdan at 2013-11-30 15:36:55
你扩增质粒上的序列不是你样品的基因吧？

是一样的啊，质粒是用相同的DNA进行pcr之后胶回收在转化链接后培养然后用试剂盒提取的

4楼2013-12-01 08:44:15

Irus

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3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-01 02:41:44
说明产物不相同。核对一下序列差别和引物特异性。

产物检测后都在250bp左右，唯一的不同是质粒的条带很细，样品的条带很宽，这样的话应该是调整样品pcr反映体系让条带变细吧

5楼2013-12-01 08:46:51

cicelyzh

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5楼: Originally posted by Irus at 2013-12-01 08:46:51
产物检测后都在250bp左右，唯一的不同是质粒的条带很细，样品的条带很宽，这样的话应该是调整样品pcr反映体系让条带变细吧...

跑电泳的分辨率不是很高，即使是一条带也有可能是分子量接近的不同分子的混合物。熔解曲线的温度不仅和产物长度有关，产物的序列也会影响熔解温度，所以更加灵敏。我觉得你的引物的特异性可能有问题。如果是质粒，模板序列单一，所以是一个产物。样品模板成分复杂，可能有多种产物。

6楼2013-12-01 14:38:09

Irus

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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-01 14:38:09
跑电泳的分辨率不是很高，即使是一条带也有可能是分子量接近的不同分子的混合物。熔解曲线的温度不仅和产物长度有关，产物的序列也会影响熔解温度，所以更加灵敏。我觉得你的引物的特异性可能有问题。如果是质粒， ...

引物的特异性应该是没问题的，是细菌的通用引物338和518，我们实验室的其他人也用的这个，做的还行啊，就到我这里我重新提取的质粒那个峰很窄，我做了别的菌像尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的质粒熔解曲线也都很宽，是不是我这个质粒提取的有问题。

7楼2013-12-02 14:10:41

cicelyzh

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7楼: Originally posted by Irus at 2013-12-02 14:10:41
引物的特异性应该是没问题的，是细菌的通用引物338和518，我们实验室的其他人也用的这个，做的还行啊，就到我这里我重新提取的质粒那个峰很窄，我做了别的菌像尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的质粒熔解曲线也都很宽，是不是 ...

熔解峰应该是比较窄的，你提取质粒的那个在我看来是正常的。宽熔解峰说明产物在较大温度范围下熔解，有可能非单一峰。

8楼2013-12-03 02:03:59