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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上
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Irus

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上 已有1人参与

如图，检测结果发现样品的条带较宽
荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上
熔解曲线
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1楼 2013-11-30 15:33:18
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yuxiangdan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-30 16:12:55
你扩增质粒上的序列不是你样品的基因吧？

[ 发自小木虫客户端 ]
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成功者永不放弃，放弃者永不成功。
2楼2013-11-30 15:36:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-02 16:08:21
Irus: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-12-19 18:47:54
说明产物不相同。核对一下序列差别和引物特异性。
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3楼2013-12-01 02:41:44
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Irus

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuxiangdan at 2013-11-30 15:36:55
你扩增质粒上的序列不是你样品的基因吧？

是一样的啊，质粒是用相同的DNA进行pcr之后胶回收在转化链接后培养然后用试剂盒提取的
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4楼2013-12-01 08:44:15
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Irus

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-01 02:41:44
说明产物不相同。核对一下序列差别和引物特异性。

产物检测后都在250bp左右，唯一的不同是质粒的条带很细，样品的条带很宽，这样的话应该是调整样品pcr反映体系让条带变细吧
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5楼2013-12-01 08:46:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-02 16:08:38
引用回帖:
5楼: Originally posted by Irus at 2013-12-01 08:46:51
产物检测后都在250bp左右，唯一的不同是质粒的条带很细，样品的条带很宽，这样的话应该是调整样品pcr反映体系让条带变细吧...

跑电泳的分辨率不是很高，即使是一条带也有可能是分子量接近的不同分子的混合物。熔解曲线的温度不仅和产物长度有关，产物的序列也会影响熔解温度，所以更加灵敏。我觉得你的引物的特异性可能有问题。如果是质粒，模板序列单一，所以是一个产物。样品模板成分复杂，可能有多种产物。
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6楼2013-12-01 14:38:09
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Irus

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-01 14:38:09
跑电泳的分辨率不是很高，即使是一条带也有可能是分子量接近的不同分子的混合物。熔解曲线的温度不仅和产物长度有关，产物的序列也会影响熔解温度，所以更加灵敏。我觉得你的引物的特异性可能有问题。如果是质粒， ...

引物的特异性应该是没问题的，是细菌的通用引物338和518，我们实验室的其他人也用的这个，做的还行啊，就到我这里我重新提取的质粒那个峰很窄，我做了别的菌像尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的质粒熔解曲线也都很宽，是不是我这个质粒提取的有问题。
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7楼2013-12-02 14:10:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Irus at 2013-12-02 14:10:41
引物的特异性应该是没问题的，是细菌的通用引物338和518，我们实验室的其他人也用的这个，做的还行啊，就到我这里我重新提取的质粒那个峰很窄，我做了别的菌像尖孢镰刀菌和芽孢杆菌的质粒熔解曲线也都很宽，是不是 ...

熔解峰应该是比较窄的，你提取质粒的那个在我看来是正常的。宽熔解峰说明产物在较大温度范围下熔解，有可能非单一峰。
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8楼2013-12-03 02:03:59
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real-time

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品纯度不够，有杂质（离子？）干扰，影响扩增和产物的溶解曲线
试试纯化样品再实验看
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
9楼2013-12-03 11:44:11
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Irus

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-03 02:03:59
熔解峰应该是比较窄的，你提取质粒的那个在我看来是正常的。宽熔解峰说明产物在较大温度范围下熔解，有可能非单一峰。...

非单一峰不是会出现二聚体或非特异性扩增么，我这个都没有啊，这个是我pcr产物的电泳图片
荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上-1
c2158606264 - Crop 1.jpg
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10楼2013-12-05 08:28:14
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