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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量pcr熔解曲线问题——质粒与样品的峰不在一条上
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Irus

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by real-time at 2013-12-03 11:44:11
样品纯度不够，有杂质（离子？）干扰，影响扩增和产物的溶解曲线
试试纯化样品再实验看

纯化样品是指纯化DNA么？
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11楼2013-12-05 08:30:41
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real-time

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by Irus at 2013-12-05 08:30:41
纯化样品是指纯化DNA么？...

是的
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
12楼2013-12-05 11:34:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by Irus at 2013-12-05 08:28:14
非单一峰不是会出现二聚体或非特异性扩增么，我这个都没有啊，这个是我pcr产物的电泳图片

c2158606264 - Crop 1.jpg
...

如果仔细看，我觉得在你的亮带下面有一条模糊的暗带。
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13楼2013-12-05 16:07:49
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Irus

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-05 16:07:49
如果仔细看，我觉得在你的亮带下面有一条模糊的暗带。...

那个是有一点模糊的二聚体，但是二聚体应该是出现一个单一峰的，而且和主条带之间有一定距离的，不会和主峰混成一个峰啊
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14楼2013-12-06 08:24:21
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小小书虫-pig

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我感觉是你的模板里面的存在大小不一的片段，也就是模板的特异性不是很好。溶解曲线反应的是模板的特异性，建议你可以试着纯化一下模板，再进行qPCR！
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15楼2013-12-06 09:53:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by Irus at 2013-12-06 08:24:21
那个是有一点模糊的二聚体，但是二聚体应该是出现一个单一峰的，而且和主条带之间有一定距离的，不会和主峰混成一个峰啊...

的确是你说的，引物二聚体的熔解温度通常比较低。确定是否是引物二聚体可以上一个无模板的反应，如果出现扩增，看看其熔解曲线的位置和形状。
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16楼2013-12-06 14:03:18
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ling-1314

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不知道LZ还会不会看到我的留言，我最近也一直在做土壤中细菌，芽孢杆菌，尖镰胞菌群的荧光定量，现在遇到了很大的问题，就是我的芽孢杆菌的拷贝数比较高，不知道LZ你的数量级大概是多少？我不知道是不是自己的质粒出了问题？LZ，要是看到留言，一定要回复啊
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17楼2015-12-14 23:08:27
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