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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 荧光定量Ct值
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量Ct值

请问下做半定量内参基因条带正常，目的基因表达量很低条带很弱。再拿去做荧光定量内参的Ct值是23也正常，但是目的基因Ct值是15，按道理这种情况目的基因Ct值不是应该较大吗？ 还是因为表达量太小，导致仪器检测荧光有问题？
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1楼 2013-11-28 12:39:51
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zds2257: 金币+2 2013-11-28 16:51:40
zds2257: 金币+18, 3个重复 相对定量模板浓度没调 2013-11-28 16:53:56
我也觉着怪异啊，怎么CT值反而小了,做了几个重复啊，模板一样多吗
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2楼2013-11-28 13:00:47
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zds2257: 金币+2 2013-11-28 16:58:52
拿荧光PCR产物跑个电泳看看长度对不对。看熔解曲线的Tm值是否异常。是不是引物二聚体或非特异扩增？
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3楼2013-11-28 14:09:04
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-11-28 14:09:04
拿荧光PCR产物跑个电泳看看长度对不对。看熔解曲线的Tm值是否异常。是不是引物二聚体或非特异扩增？

普通PCR跑的半定量  条带单一没有其他杂带  荧光PCR产物跑完都不管了
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4楼2013-11-28 16:57:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zds2257: 金币+2 2013-11-29 14:22:04
做荧光定量时目的基因扩增曲线是否正常，熔解曲线峰是否单一？
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5楼2013-11-28 17:16:38
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-11-29 08:42:59
silicare: 金币+3, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2013-11-29 09:13:10
引用回帖:
4楼: Originally posted by zds2257 at 2013-11-28 16:57:22
普通PCR跑的半定量  条带单一没有其他杂带  荧光PCR产物跑完都不管了...

我习惯保留荧光PCR产物跑电泳，因为即使PCR条件再稳定，也是容易出现意想不到的问题的，一旦出问题，一个电泳结果能直接确定PCR过程出现的问题。你半定量和荧光PCR条件是一样的，两步法？
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6楼2013-11-29 08:21:23
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-11-30 10:53:02
引用回帖:
6楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-11-29 08:21:23
我习惯保留荧光PCR产物跑电泳，因为即使PCR条件再稳定，也是容易出现意想不到的问题的，一旦出问题，一个电泳结果能直接确定PCR过程出现的问题。你半定量和荧光PCR条件是一样的，两步法？...

条件一样  三步法
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7楼2013-11-29 14:19:43
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zds2257

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-28 17:16:38
做荧光定量时目的基因扩增曲线是否正常，熔解曲线峰是否单一？

回头看看  这条件和半定量用的一样  半定量是条带很特异啊
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8楼2013-11-29 14:23:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zds2257 at 2013-11-29 14:23:06
回头看看  这条件和半定量用的一样  半定量是条带很特异啊...

半定量与荧光定量用的试剂和酶不同，有时候会有些差别。从扩增曲线和熔解曲线是否有异常多少可以看出PCR体系是否建立得正确，模板浓度是否合适。
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9楼2013-11-30 02:40:37
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
zds2257: 金币+2 2013-12-05 13:05:07
要看你的曲线是什么样的，可能阈值线太低，接触到荧光检测不稳定波动区的突起
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10楼2013-12-04 17:32:07
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