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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » WB实验问题求助
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baiwei57

金虫 (正式写手)

[求助] WB实验问题求助

组蛋白H3荧光信号很强，但是曝光H3K9二甲基化位点和H3K4甲基化却无荧光，上样量及实验条件完全一致，请问什么原因？如何改进？
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好好过每一天
1楼 2013-11-26 18:02:35
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953162729

铜虫 (初入文坛)
不知道啊
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············
2楼2013-11-26 18:03:15
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953162729

铜虫 (初入文坛)
3楼2013-11-26 18:05:28
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-26 19:14:17
baiwei57: 金币+2, ★有帮助 2013-11-26 20:08:26
甲基化后造成蛋白空间结构改变，结合基团被包埋导致曝光失败，这个以前遇到过的   也不是所有蛋白修饰后都会这样   运气比较差而已
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孤独的舞者
4楼2013-11-26 18:38:19
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)
？跑电泳之前不是煮沸变性了吗，蛋白空间结构应该打开了呀，我看文献做的是小鼠肾脏，还有心脏的组蛋白H3的甲基化修饰都曝出来了
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
5楼2013-11-26 19:33:03
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woai43

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:38:34
gyesang: 回帖置顶 2013-11-27 12:38:35
baiwei57: 金币+2 2013-11-28 12:17:27
H3K9me2和H3K4me相对H3丰度低，估计是抗体的问题。如果有人工合成的带有H3K9me2修饰的histone tail，建议做个dot blot ，确定抗体是否能够识别这一修饰。
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6楼2013-11-27 11:11:57
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by woai43 at 2013-11-27 11:11:57
H3K9me2和H3K4me相对H3丰度低，估计是抗体的问题。如果有人工合成的带有H3K9me2修饰的histone tail，建议做个dot blot ，确定抗体是否能够识别这一修饰。

抗体是一家公司（CST）的，同时买的，抗体说明书上的WB图片条带很清晰
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
7楼2013-11-27 15:37:03
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woai43

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-29 14:15:13
引用回帖:
7楼: Originally posted by tupeipei at 2013-11-27 15:37:03
抗体是一家公司（CST）的，同时买的，抗体说明书上的WB图片条带很清晰...

抗体说明书的WB样品跟你的实验样品是否是一类样品，WB上样的量，H3K9me2修饰的丰度，提取方法都可能不相同。同一家公司的不同抗体未必都是好的，现在是你抗出来没有信号，首先就应该排除抗体不好的因素，如果你认为抗体是没有问题的，那可能就只能从提高loading量上入手了。
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8楼2013-11-27 16:27:08
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shawn2006

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
baiwei57: 金币+2 2013-11-29 11:18:27
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-29 14:15:04
本帖内容被屏蔽
9楼2013-11-29 00:08:20
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)
呵呵，已经做出来了，一抗从室温2h改成4度过夜就暴出来了
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
10楼2014-04-14 21:47:23
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