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baiwei57

金虫 (正式写手)

[求助] WB实验问题求助

组蛋白H3荧光信号很强,但是曝光H3K9二甲基化位点和H3K4甲基化却无荧光,上样量及实验条件完全一致,请问什么原因?如何改进?
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好好过每一天
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953162729

铜虫 (初入文坛)

············
2楼2013-11-26 18:03:15
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953162729

铜虫 (初入文坛)

3楼2013-11-26 18:05:28
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-26 19:14:17
baiwei57: 金币+2, ★有帮助 2013-11-26 20:08:26
甲基化后造成蛋白空间结构改变,结合基团被包埋导致曝光失败,这个以前遇到过的   也不是所有蛋白修饰后都会这样   运气比较差而已
孤独的舞者
4楼2013-11-26 18:38:19
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)

?跑电泳之前不是煮沸变性了吗,蛋白空间结构应该打开了呀,我看文献做的是小鼠肾脏,还有心脏的组蛋白H3的甲基化修饰都曝出来了
实验虐我千百遍,我待实验如初恋
5楼2013-11-26 19:33:03
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woai43

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-27 12:38:34
gyesang: 回帖置顶 2013-11-27 12:38:35
baiwei57: 金币+2 2013-11-28 12:17:27
H3K9me2和H3K4me相对H3丰度低,估计是抗体的问题。如果有人工合成的带有H3K9me2修饰的histone tail,建议做个dot blot ,确定抗体是否能够识别这一修饰。
6楼2013-11-27 11:11:57
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by woai43 at 2013-11-27 11:11:57
H3K9me2和H3K4me相对H3丰度低,估计是抗体的问题。如果有人工合成的带有H3K9me2修饰的histone tail,建议做个dot blot ,确定抗体是否能够识别这一修饰。

抗体是一家公司(CST)的,同时买的,抗体说明书上的WB图片条带很清晰
实验虐我千百遍,我待实验如初恋
7楼2013-11-27 15:37:03
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woai43

金虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-29 14:15:13
引用回帖:
7楼: Originally posted by tupeipei at 2013-11-27 15:37:03
抗体是一家公司(CST)的,同时买的,抗体说明书上的WB图片条带很清晰...

抗体说明书的WB样品跟你的实验样品是否是一类样品,WB上样的量,H3K9me2修饰的丰度,提取方法都可能不相同。同一家公司的不同抗体未必都是好的,现在是你抗出来没有信号,首先就应该排除抗体不好的因素,如果你认为抗体是没有问题的,那可能就只能从提高loading量上入手了。
8楼2013-11-27 16:27:08
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shawn2006

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
baiwei57: 金币+2 2013-11-29 11:18:27
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-29 14:15:04
本帖内容被屏蔽

9楼2013-11-29 00:08:20
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tupeipei

铜虫 (初入文坛)

呵呵,已经做出来了,一抗从室温2h改成4度过夜就暴出来了
实验虐我千百遍,我待实验如初恋
10楼2014-04-14 21:47:23
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