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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 琼脂糖凝胶电泳怪现象
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳怪现象

求助：我用分子量为4000bp左右的质粒跑琼脂糖电泳，点的marker为2000的，每次跑胶的结果中4000bp的目的条带与marker中2000的条带的距离有时近有时远，距离不定，请问这是为什么啊？
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1楼 2013-11-15 12:48:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-15 16:10:58
tiankong很蓝: 金币+5, ★有帮助 2013-11-18 16:53:47
首先你的质粒有没有做过酶切，没有的话由于不同的分子构型，可能会不能体现真正的分子量大小，第二，选用适合的marker，才能正确体现分子量的大小，每次行胶的条件不一致，必然看起来每次不同
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3楼2013-11-15 15:15:43
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-15 16:27:24
质粒提取后没有酶切的话，应该有三条条带。如果只有一条那就不对。另外，电泳过程中胶的质量不同和电泳电压等条件都会出现条带距离不定的现象。
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我不会！
4楼2013-11-15 16:24:58
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liulugang

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by tiankong很蓝 at 2013-11-18 11:31:49
是啊，每次酶切后相同质粒条带的位置都有变化，而且变化还很大。不知道是为什么...

提取的质粒大多以超螺旋或开环构型存在，酶切过后，质粒呈线性状态，跑胶结果相对于超螺旋或开环肯定会变化。lz有做单切和空白对照吗？这样有助于您判断跑胶位置变化的原因。
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11楼2013-11-18 14:09:38
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
tiankong很蓝: 金币+5 2013-11-19 09:05:04
看了你的图后
1第一甬道的是质粒，有3条带，大量的是超螺旋，说明质粒提的还可以，酶切后有两条带，但是小条带分子量与预期不符，看看原始质粒是否正确，换一个含有5kb-4kb的marker，用单酶切成一条带看条带大小对不对，否则光用眼睛看是不准的
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15楼2013-11-19 08:54:31
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普通回帖

bolysu

禁虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-15 16:27:18
本帖内容被屏蔽
2楼2013-11-15 13:44:24
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2013-11-15 13:44:24
这个和你提的质粒质量有关的，质量好就会小，质量不好就会大

可我是用提取的同一批质粒跑电泳，结果不同
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5楼2013-11-15 18:11:38
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没有酶切的质粒电泳主要是看看有没有，判断大小要酶切
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6楼2013-11-15 19:30:02
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by doglet at 2013-11-15 15:15:43
首先你的质粒有没有做过酶切，没有的话由于不同的分子构型，可能会不能体现真正的分子量大小，第二，选用适合的marker，才能正确体现分子量的大小，每次行胶的条件不一致，必然看起来每次不同

我有做双酶切，但是酶切结果一直得不到所需片段（所需片段是796bp，但酶切后出现的片段有时在marker的1000处有时在500bp处），而且只有少量酶切片段，大量质粒没有切开。一直找不到原因，不知道为什么得不到目的片段，猜想是不是marker的原因，有可能在1000处或500bp处的酶切片段就是我所需要的。您说，有可能吗？
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7楼2013-11-15 20:24:05
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-11-15 16:24:58
质粒提取后没有酶切的话，应该有三条条带。如果只有一条那就不对。另外，电泳过程中胶的质量不同和电泳电压等条件都会出现条带距离不定的现象。

但是目的条带出现的位置差异很大，胶的质量和电压等条件会有这么大影响吗。（我一般用：0.25g琼脂糖+25mLTAE缓冲液，60V、40mA电泳）
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8楼2013-11-15 20:29:00
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

琼脂糖应用浓度表示，用g数表示不能代表浓度大小，电流和电压不是问题，酶切后与marker相比较才能确定正确大小，否则怎样都是不确定的
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9楼2013-11-16 07:11:40
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tiankong很蓝

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by doglet at 2013-11-16 07:11:40
琼脂糖应用浓度表示，用g数表示不能代表浓度大小，电流和电压不是问题，酶切后与marker相比较才能确定正确大小，否则怎样都是不确定的

是啊，每次酶切后相同质粒条带的位置都有变化，而且变化还很大。不知道是为什么
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10楼2013-11-18 11:31:49
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