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原核表达只能在沉淀中检测出目标蛋白怎么办
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| 本人老板现在让我师兄做原核表达 目标蛋白68kD(531aa) 用的PET-28a表达载体 做了好久一直只能在37℃用0.4M IPTG条件下诱导出来 并且只能在沉淀中检测出来 但最近37℃沉淀中也检测不到目标蛋白 请各位大神帮忙分析一下可能的原因 顺便介绍下怎样才能让它表达出可溶性的蛋白比如优化条件 |
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 蛋白质生物学实验经验 | 细胞生物学实验经验 |
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sunpeng9907
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sunpeng9907
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8楼2013-10-07 22:24:47
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原核细胞的表达产物蛋白质表达量过大或者折叠异常引起产物形成沉淀，如果再明显一些就形成了砂粒状的包涵体。 防止包涵体形成的方法，楼主都可以用上。 防止包涵体出现常用的方法： 1.降低重组菌的生长温度是防止包涵体出现最常用的方法。低生长温度降低了无活性的聚集体的形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平降低，也可以减少包涵体的形成。2.在培养重组菌时提供丰富的培养，创造最好的培养条件，如：供氧充足、合适的pH值等，以减少包涵体的形成。3.添加可促进重组蛋白质可溶性表达生长添加剂，增加细胞的渗透压。4.在低浓度的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白质的表达量，也可减少包涵体的形成。5.利用硫氧还原蛋白融合表达或与目标蛋白质共表达，得到可溶性的蛋白质。6.筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白质可溶。7.与目标蛋白质共表达某些能够在目标蛋白质折叠过程中起作用的分子伴侣，得到可溶性的蛋白质。 不过，形成沉淀也不完全是坏事，比如分离提纯可能比较容易了。 至于从沉淀中获得活性蛋白质的方法，只要参照包涵体复性的试验方法即可，也就是变性剂溶解沉淀物，然后进行稀释，并用超滤或者层析除去变性剂。 Purification of inclusion bodies and refolding of proteins http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html |
9楼2013-10-08 01:08:19
10楼2014-04-15 14:32:28