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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达只能在沉淀中检测出目标蛋白怎么办
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云中风华

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达只能在沉淀中检测出目标蛋白怎么办

本人老板现在让我师兄做原核表达  目标蛋白68kD(531aa) 用的PET-28a表达载体   做了好久一直只能在37℃用0.4M IPTG条件下诱导出来  并且只能在沉淀中检测出来  但最近37℃沉淀中也检测不到目标蛋白   请各位大神帮忙分析一下可能的原因  顺便介绍下怎样才能让它表达出可溶性的蛋白比如优化条件
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1楼 2013-10-06 16:49:27
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sunpeng9907

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-06 18:07:09
云中风华: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-10-07 21:21:04
N端加信号肽，探索诱导温度及诱导时间。
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2楼2013-10-06 17:20:54
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John_Chen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-06 18:07:18
云中风华: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-10-07 21:21:22
建议：（1）改变诱导温度和IPTG浓度
（2）换载体，如GST标签的载体
祝实验顺利！
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勤能补拙
3楼2013-10-06 17:52:39
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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云中风华: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-10-07 21:22:14
目标蛋白是什么物种的？如果你用原核表达真核生物的蛋白基本都是没有活性的，因为原核生物没有分子伴侣不能正确折叠。也许是因为折叠不正确导致蛋白的亲水能力下降才沉淀。你可以试试放到酵母里表达，也许就有可溶性的蛋白表达出来了。
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4楼2013-10-06 20:04:49
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
云中风华: 金币+1, ★有帮助 2013-10-07 21:22:24
同意三楼的建议，如果还不行，只能进行沉淀的复性操作了。
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5楼2013-10-07 08:47:33
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631449226

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pet中文指南上有详细信息
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6楼2013-10-07 11:05:24
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云中风华

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qapollo at 2013-10-06 20:04:49
目标蛋白是什么物种的？如果你用原核表达真核生物的蛋白基本都是没有活性的，因为原核生物没有分子伴侣不能正确折叠。也许是因为折叠不正确导致蛋白的亲水能力下降才沉淀。你可以试试放到酵母里表达，也许就有可溶性 ...

目标蛋白是家蚕的类胡萝卜素基因。。。本人觉得想要获得有活性的蛋白用原核表达可能性不大，敢问酵母这个复杂吗？那块可以看到具体的方案   谢谢了
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7楼2013-10-07 21:25:25
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sunpeng9907

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 云中风华 at 2013-10-07 21:25:25
目标蛋白是家蚕的类胡萝卜素基因。。。本人觉得想要获得有活性的蛋白用原核表达可能性不大，敢问酵母这个复杂吗？那块可以看到具体的方案   谢谢了...

如果用酵母，要考虑胞内表达和分泌表达。如果用分泌表达，目的蛋白中有潜在糖基化位点，就要考虑糖基化问题。
可根据目的蛋白在其天然宿主中的表达方式来定表达方案。
仅供参考
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8楼2013-10-07 22:24:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
原核细胞的表达产物蛋白质表达量过大或者折叠异常引起产物形成沉淀，如果再明显一些就形成了砂粒状的包涵体。

防止包涵体形成的方法，楼主都可以用上。

防止包涵体出现常用的方法：

1.降低重组菌的生长温度是防止包涵体出现最常用的方法。低生长温度降低了无活性的聚集体的形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平降低，也可以减少包涵体的形成。2.在培养重组菌时提供丰富的培养，创造最好的培养条件，如：供氧充足、合适的pH值等，以减少包涵体的形成。3.添加可促进重组蛋白质可溶性表达生长添加剂，增加细胞的渗透压。4.在低浓度的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白质的表达量，也可减少包涵体的形成。5.利用硫氧还原蛋白融合表达或与目标蛋白质共表达，得到可溶性的蛋白质。6.筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白质可溶。7.与目标蛋白质共表达某些能够在目标蛋白质折叠过程中起作用的分子伴侣，得到可溶性的蛋白质。

不过，形成沉淀也不完全是坏事，比如分离提纯可能比较容易了。

至于从沉淀中获得活性蛋白质的方法，只要参照包涵体复性的试验方法即可，也就是变性剂溶解沉淀物，然后进行稀释，并用超滤或者层析除去变性剂。

Purification of inclusion bodies and refolding of proteins
http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html
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9楼2013-10-08 01:08:19
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firedrop

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qapollo at 2013-10-06 20:04:49
目标蛋白是什么物种的？如果你用原核表达真核生物的蛋白基本都是没有活性的，因为原核生物没有分子伴侣不能正确折叠。也许是因为折叠不正确导致蛋白的亲水能力下降才沉淀。你可以试试放到酵母里表达，也许就有可溶性 ...

原核里是有分子伴侣的
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10楼2014-04-15 14:32:28
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