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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 亲们，你们的包涵体蛋白透析会出现沉淀么，郁闷啊，能不能给只个招？？？
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

[求助] 亲们，你们的包涵体蛋白透析会出现沉淀么，郁闷啊，能不能给只个招？？？

最近大量表达一种蛋白，蛋白表达量尚可，因为希望能够走工艺流程，所以蛋白的纯化出现问题，表达的蛋白在包涵体中，后期纯化是，8M尿素透析，然后选用PBS透析，但是蛋白总是沉淀，如何才能使得蛋白不沉淀呢，是不是只有加大尿素用量？但是到最后用PEG浓缩可以么？你们的包涵体都是怎么纯化的啊，有没有做这一方面的孩子啊，整天纯化蛋白，然后总是沉，郁闷啊，郁闷啊
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1楼 2012-11-13 16:55:41
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-21 17:29:21
sarah-miao: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-12-03 20:16:00
我之前也遇见过这种情况，后来分级透析，逐步在6M、4M、2M、1M透析2小时，然后PBS缓冲液里面透析过夜，几乎没有沉淀，楼主可以试试，不过可能和蛋白本身性质关系也很大，我也做过一个蛋白怎么透析都有沉淀的，但是沉淀里有目的蛋白，缓冲液也有，并且量还不错，就直接弃掉沉淀了。
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2楼2012-11-14 11:30:49
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bclz at 2012-11-14 11:30:49
我之前也遇见过这种情况，后来分级透析，逐步在6M、4M、2M、1M透析2小时，然后PBS缓冲液里面透析过夜，几乎没有沉淀，楼主可以试试，不过可能和蛋白本身性质关系也很大，我也做过一个蛋白怎么透析都有沉淀的，但是沉 ...

嗯嗯，谢谢啦，我最近就用尿素透析的，没那么分好多步骤，直接8M尿素溶剂，然后2M 、0.5M透析，效果还不错，想用PBS再透析，但是发现蛋白还是会沉掉，所以就直接测浓度了，就没透析，跑出来的SDA-PAGE胶很干净的说。。。
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3楼2012-11-21 10:39:40
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-21 17:29:36
不沉淀容易，保持一定的活性就很难。

可以试试看，用很浓的溶液（8M尿素）直接滴到大量buffer（100倍体积或者更大）里面，突然复性，这样浓度很低，不至于沉淀。

还可以试试，reduced reagent (MbE, 或者DTT)
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2012-11-21 15:29:38
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2012-11-21 15:29:38
不沉淀容易，保持一定的活性就很难。

可以试试看，用很浓的溶液（8M尿素）直接滴到大量buffer（100倍体积或者更大）里面，突然复性，这样浓度很低，不至于沉淀。

还可以试试，reduced reagent (MbE, 或者DTT)

额，貌似我忘记做western了，哎，回头再试着看下最后用0.5M尿素透析的有没有活性看看。。。谢谢啦
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5楼2012-11-21 20:07:36
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-21 10:39:40
嗯嗯，谢谢啦，我最近就用尿素透析的，没那么分好多步骤，直接8M尿素溶剂，然后2M 、0.5M透析，效果还不错，想用PBS再透析，但是发现蛋白还是会沉掉，所以就直接测浓度了，就没透析，跑出来的SDA-PAGE胶很干净的说 ...

对了，你透析的尿素调PH值的么？
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6楼2012-12-25 21:51:05
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