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sarah-miao

银虫 (正式写手)

[求助] 亲们,你们的包涵体蛋白透析会出现沉淀么,郁闷啊,能不能给只个招???

最近大量表达一种蛋白,蛋白表达量尚可,因为希望能够走工艺流程,所以蛋白的纯化出现问题,表达的蛋白在包涵体中,后期纯化是,8M尿素透析,然后选用PBS透析,但是蛋白总是沉淀,如何才能使得蛋白不沉淀呢,是不是只有加大尿素用量?但是到最后用PEG浓缩可以么?你们的包涵体都是怎么纯化的啊,有没有做这一方面的孩子啊,整天纯化蛋白,然后总是沉,郁闷啊,郁闷啊
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-21 17:29:21
sarah-miao: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-12-03 20:16:00
我之前也遇见过这种情况,后来分级透析,逐步在6M、4M、2M、1M透析2小时,然后PBS缓冲液里面透析过夜,几乎没有沉淀,楼主可以试试,不过可能和蛋白本身性质关系也很大,我也做过一个蛋白怎么透析都有沉淀的,但是沉淀里有目的蛋白,缓冲液也有,并且量还不错,就直接弃掉沉淀了。
2楼2012-11-14 11:30:49
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bclz at 2012-11-14 11:30:49
我之前也遇见过这种情况,后来分级透析,逐步在6M、4M、2M、1M透析2小时,然后PBS缓冲液里面透析过夜,几乎没有沉淀,楼主可以试试,不过可能和蛋白本身性质关系也很大,我也做过一个蛋白怎么透析都有沉淀的,但是沉 ...

嗯嗯,谢谢啦,我最近就用尿素透析的,没那么分好多步骤,直接8M尿素溶剂,然后2M 、0.5M透析,效果还不错,想用PBS再透析,但是发现蛋白还是会沉掉,所以就直接测浓度了,就没透析,跑出来的SDA-PAGE胶很干净的说。。。
3楼2012-11-21 10:39:40
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-21 17:29:36
不沉淀容易,保持一定的活性就很难。

可以试试看,用很浓的溶液(8M尿素)直接滴到大量buffer(100倍体积或者更大)里面,突然复性,这样浓度很低,不至于沉淀。

还可以试试,reduced reagent (MbE, 或者DTT)
行至水穷处,坐看云起时
4楼2012-11-21 15:29:38
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2012-11-21 15:29:38
不沉淀容易,保持一定的活性就很难。

可以试试看,用很浓的溶液(8M尿素)直接滴到大量buffer(100倍体积或者更大)里面,突然复性,这样浓度很低,不至于沉淀。

还可以试试,reduced reagent (MbE, 或者DTT)

额,貌似我忘记做western了,哎,回头再试着看下最后用0.5M尿素透析的有没有活性看看。。。谢谢啦
5楼2012-11-21 20:07:36
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-21 10:39:40
嗯嗯,谢谢啦,我最近就用尿素透析的,没那么分好多步骤,直接8M尿素溶剂,然后2M 、0.5M透析,效果还不错,想用PBS再透析,但是发现蛋白还是会沉掉,所以就直接测浓度了,就没透析,跑出来的SDA-PAGE胶很干净的说 ...

对了,你透析的尿素调PH值的么?
6楼2012-12-25 21:51:05
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