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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达只能在沉淀中检测出目标蛋白怎么办
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云中风华

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达只能在沉淀中检测出目标蛋白怎么办

本人老板现在让我师兄做原核表达  目标蛋白68kD(531aa) 用的PET-28a表达载体   做了好久一直只能在37℃用0.4M IPTG条件下诱导出来  并且只能在沉淀中检测出来  但最近37℃沉淀中也检测不到目标蛋白   请各位大神帮忙分析一下可能的原因  顺便介绍下怎样才能让它表达出可溶性的蛋白比如优化条件
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1楼 2013-10-06 16:49:27
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sunpeng9907

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 云中风华 at 2013-10-07 21:25:25
目标蛋白是家蚕的类胡萝卜素基因。。。本人觉得想要获得有活性的蛋白用原核表达可能性不大，敢问酵母这个复杂吗？那块可以看到具体的方案   谢谢了...

如果用酵母，要考虑胞内表达和分泌表达。如果用分泌表达，目的蛋白中有潜在糖基化位点，就要考虑糖基化问题。
可根据目的蛋白在其天然宿主中的表达方式来定表达方案。
仅供参考
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8楼2013-10-07 22:24:47
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sunpeng9907

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-06 18:07:09
云中风华: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-10-07 21:21:04
N端加信号肽，探索诱导温度及诱导时间。
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2楼2013-10-06 17:20:54
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John_Chen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-10-06 18:07:18
云中风华: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-10-07 21:21:22
建议：（1）改变诱导温度和IPTG浓度
（2）换载体，如GST标签的载体
祝实验顺利！
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勤能补拙
3楼2013-10-06 17:52:39
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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云中风华: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-10-07 21:22:14
目标蛋白是什么物种的？如果你用原核表达真核生物的蛋白基本都是没有活性的，因为原核生物没有分子伴侣不能正确折叠。也许是因为折叠不正确导致蛋白的亲水能力下降才沉淀。你可以试试放到酵母里表达，也许就有可溶性的蛋白表达出来了。
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4楼2013-10-06 20:04:49
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