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witake

银虫 (正式写手)

[求助] 急求PCR 求实验指导 PCR

PCR
引物nearest  neighbor 都在55度左右。做57、59连个梯度是有非特异条带(BLAST过了，引物是很特异的），53 55 PCR得到的目的条带很淡，而引物条带挺亮。之前觉得是模板量少，但加大了量效果也没什么变化。25ul的体系，Taq酶是按0.2+0.1步骤加。还有一个现象就是：当我做50ul的体系有时没有目的条带，而25ul体系一般都有目的条带。现在实验不能往下做了，求各位指点迷津！
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1楼2013-09-13 10:50:46
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-09-13 22:23:28
1.试试降落PCR。强烈建议57 10个循环，55 30循环。 2.一般都是小体积的PCR效果不如大体积的，毕竟大体积的要准确稳定。但PCR仪和PCR管的导热性不良的话小体积有利。3.taq最好是多个样品预混好（一次几个样一起加1ul，然后分装）4.53,55试试极少量DMSO，应该能改善，一般不要超过2%。5,再不行，切带，做二次PCR
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2楼2013-09-13 15:35:02
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