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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于T4连接酶 大家交流下
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 关于T4连接酶 大家交流下已有8人参与

我用的是NEB公司的T4普通连接酶，我的质粒比较大有15k左右，目的片段1k，现在我要连接，我是用热击的方法好呢还是用电转好？如果用电转的话电压应该怎么设置呢？还有就是这个酶连接之后要热失活吗？以前用的不是这个公司的酶，都不用失活，可以直接转化的呀，不知这个到底需不需要？？
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1楼2013-08-27 15:44:42
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-27 21:59:11
我做过比这个还大的质粒, 用的也是NEB普通T4 DNA连接酶.
我用的是热击, 没有任何问题 (没有尝试过电转, 所以不知道两者效果差别). 不需要在热击前让酶失活.
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33ggdf
2楼2013-08-27 18:36:03
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:23:38
电转化不失活也能转，不过按照NEB说法转化效率会下降。
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3楼2013-08-27 21:29:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:23:46
不失活酶是可以的。电转化的条件主要与转化宿主与电转化杯的尺寸有关，如果用2mm的杯子，大肠杆菌的条件是2.5kv（12.5kv/cm），5ms
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4楼2013-08-27 22:08:09
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weithermo

新虫 (初入文坛)
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不用失活。为什么不用快速连接酶呢？ 赛默飞世尔有各种快速内切和连接酶，NEB也有。你可以省很多时间，有花不了太多的钱。
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5楼2013-08-28 00:52:00
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莓林塔

木虫 (小有名气)
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有酶连接体系因为离子浓度比较高最好不要用电转吧？效率会低～

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2013-08-28 09:18:18
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greenygreen

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 20:27:34
我一直用NEB的T4呢~觉得比别家都好用。正常连接。控制好插入片段的浓度，高点好！10:1或者更高些。我都是控制在10ul 的连接体系，16度16小时，4度2小时。然后就直接将10ul 的连接产物全部转化DH5a感受态。热击法就行。效率可以，电转据说效率更高！
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9楼2013-08-28 20:19:02
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33ggdf

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-08-27 18:36:03
我做过比这个还大的质粒, 用的也是NEB普通T4 DNA连接酶.
我用的是热击, 没有任何问题 (没有尝试过电转, 所以不知道两者效果差别). 不需要在热击前让酶失活.

谢谢哈 那我就放心了。这个酶你是16度过夜或者更长时间还是就放在室温下连接半个小时？？
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7楼2013-08-28 09:55:58
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-28 02:55:58
谢谢哈 那我就放心了。这个酶你是16度过夜或者更长时间还是就放在室温下连接半个小时？？...

我做的是粘端连接, 室温放半个小时
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33ggdf
8楼2013-08-28 16:12:09
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33ggdf

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-08-28 16:12:09
我做的是粘端连接, 室温放半个小时...

我发现咱做的挺像的 都是大载体 能麻烦你说一下具体的步骤吗 我第一次使用这个酶 心里没底 导师有催的急 谢谢哈譬如说你的摩尔比都设的多少等等
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10楼2013-08-28 22:46:33
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