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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于T4连接酶 大家交流下
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 关于T4连接酶 大家交流下 已有8人参与

我用的是NEB公司的T4普通连接酶，我的质粒比较大有15k左右，目的片段1k，现在我要连接，我是用热击的方法好呢还是用电转好？如果用电转的话电压应该怎么设置呢？还有就是这个酶连接之后要热失活吗？以前用的不是这个公司的酶，都不用失活，可以直接转化的呀，不知这个到底需不需要？？
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1楼 2013-08-27 15:44:42
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33ggdf

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-08-28 16:12:09
我做的是粘端连接, 室温放半个小时...

我发现咱做的挺像的 都是大载体 能麻烦你说一下具体的步骤吗 我第一次使用这个酶 心里没底 导师有催的急 谢谢哈譬如说你的摩尔比都设的多少等等
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10楼2013-08-28 22:46:33
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-27 21:59:11
我做过比这个还大的质粒, 用的也是NEB普通T4 DNA连接酶.
我用的是热击, 没有任何问题 (没有尝试过电转, 所以不知道两者效果差别). 不需要在热击前让酶失活.
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33ggdf
2楼2013-08-27 18:36:03
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:23:38
电转化不失活也能转，不过按照NEB说法转化效率会下降。
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3楼2013-08-27 21:29:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:23:46
不失活酶是可以的。电转化的条件主要与转化宿主与电转化杯的尺寸有关，如果用2mm的杯子，大肠杆菌的条件是2.5kv（12.5kv/cm），5ms
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4楼2013-08-27 22:08:09
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