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stfoxst

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[交流] 质粒连接的小窍门，很好用已有36人参与

有很多新人在做质粒的连接时总是遇到连不上、或者连接效率极低的问题。以前在网上搜到的一个方法，实验时效果很好，分享给新人。

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2013-08-19 23:43:48, 7 K

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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.

1楼2013-08-19 23:44:00

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stfoxst

银虫 (小有名气)

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1949stone: MolEPI+1, 鼓励楼主epi还是第一次不过楼主还是很好的啊 ok 2013-08-23 11:06:45
gyesang: 金币+5, 回答的真的很好！ 2013-08-23 17:57:05

看了大家的回复和提的问题，主要是关于这个protocol的原理。
首先，这个方法还是挺好用的，自己在实验中验证过。
方法估计应该是专门研究分子生物学的人想出来的，我只能试着解释。
说实在的，虽然做了十年实验了，感觉对生物学的理解还是不够深入（比如，直到前一阵子看了Biovisions才知道原来真核生物mRNA在胞质中翻译是要形成首尾连接的环形结构

），所以我只能按自己的理解说说，如果有错误，请分子生物学的大虾指正。

在RE酶切之后，DNA片段在溶液中应该是一种无规则运动（不知道算不算布朗运动，有牛人的话给解答下吧）状态；而具有相同粘性末端的片段之间的结合和解离也处于一种动态平衡中。
那么，1）温度越高，分子运动越快，单位时间内2个片段的粘性末端碰到一起的几率就越大，但是粘性末端退火的稳定性却降低；2）反之，温度越低，分子运动慢，粘性末端碰到一起的几率就越小，但是粘性末端退火的稳定性却变强了（所以一般的连接都是在16℃或者4℃进行）。
根据上述原理，回收的vector和insert混合后，加热使原有的自连稳定性降低而解离，并且使2者混合的更均匀，加大了2种分子的碰到一起的几率，然后冷却使已经形成的退火末端稳定下来，由于连接是一个概率事件（有没有做生统的大虾，按照摩尔数、温度、片段大小、溶液体积等等的参数给弄个公式，算算概率到底提高了多少倍），所以最终阳性克隆的比率得以提升。