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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒连接的小窍门，很好用
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飞啦呼啦

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by stfoxst at 2013-08-21 15:22:07
原理其实很简单，回收片段的粘性末端有时会连在一起，加热可以把vector-vector和insert-insert连接断开，从新退火后vector-insert的正确连接比例显著提升。...

谢谢您的解释，
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to be someone I dreamed of
21楼2013-08-22 10:48:03
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BlueYi213

金虫 (小有名气)
我也去试试！
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22楼2013-08-22 11:20:55
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grape_vine
谢谢分享阿
23楼2013-08-22 22:04:38
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stfoxst

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 雙子の殇 at 2013-08-21 20:18:47
谢谢楼主。。。不知道用这种方法能不能连上长片段。。

太长的没试过，我做过最长的好像是6连3，时间长了有点记不清了
你试一下然后给个反馈吧
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
24楼2013-08-23 09:10:58
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stfoxst

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 547star at 2013-08-21 23:18:56
估计针对单酶切的才有明显效果吧。

不是
pdf里举了双切为例
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
25楼2013-08-23 09:12:38
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stfoxst

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-08-22 10:20:09
我想问个问题哈。。。这个粘性末端也会发生自连吗？还请楼主帮忙解答下。。。...

pdf中举的例子讲的挺详细的。
Short explanation:
your insert is EcoRI/SalI
and vector is EcoRI/SalI
The heating step will break all the UNWANTED AND TOTALLY USELESS
insert-insert and vector-vector bindings. After the heating step MANY good vector-insert bindings will occur and your plates will be full of good transformants.
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
26楼2013-08-23 09:29:08
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stfoxst

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by sky10016 at 2013-08-21 20:58:22
我做了很长时间的连接，就是从来没有成功过。我试试你给的这个方法！

虽然酶切连接是最基础的技术，不过影响因素挺多的，个人感觉最重要的是片段要纯、酶切完全
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
27楼2013-08-23 09:35:17
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stfoxst

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
1949stone: MolEPI+1, 鼓励楼主epi还是第一次 不过 楼主还是很好的啊 ok 2013-08-23 11:06:45
gyesang: 金币+5, 回答的真的很好！ 2013-08-23 17:57:05
看了大家的回复和提的问题，主要是关于这个protocol的原理。
首先，这个方法还是挺好用的，自己在实验中验证过。
方法估计应该是专门研究分子生物学的人想出来的，我只能试着解释。
说实在的，虽然做了十年实验了，感觉对生物学的理解还是不够深入（比如，直到前一阵子看了Biovisions才知道原来真核生物mRNA在胞质中翻译是要形成首尾连接的环形结构），所以我只能按自己的理解说说，如果有错误，请分子生物学的大虾指正。

在RE酶切之后，DNA片段在溶液中应该是一种无规则运动（不知道算不算布朗运动，有牛人的话给解答下吧）状态；而具有相同粘性末端的片段之间的结合和解离也处于一种动态平衡中。
那么，1）温度越高，分子运动越快，单位时间内2个片段的粘性末端碰到一起的几率就越大，但是粘性末端退火的稳定性却降低；2）反之，温度越低，分子运动慢，粘性末端碰到一起的几率就越小，但是粘性末端退火的稳定性却变强了（所以一般的连接都是在16℃或者4℃进行）。
根据上述原理，回收的vector和insert混合后，加热使原有的自连稳定性降低而解离，并且使2者混合的更均匀，加大了2种分子的碰到一起的几率，然后冷却使已经形成的退火末端稳定下来，由于连接是一个概率事件（有没有做生统的大虾，按照摩尔数、温度、片段大小、溶液体积等等的参数给弄个公式，算算概率到底提高了多少倍），所以最终阳性克隆的比率得以提升。
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
28楼2013-08-23 10:22:17
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sky10016
引用回帖:
27楼: Originally posted by stfoxst at 2013-08-23 09:35:17
虽然酶切连接是最基础的技术，不过影响因素挺多的，个人感觉最重要的是片段要纯、酶切完全...

29楼2013-08-23 14:44:02
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hgh99618

金虫 (正式写手)
好啊！很实用。
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30楼2013-08-23 15:36:23
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