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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western配胶的问题
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亲爱的景景

新虫 (初入文坛)

[求助] Western配胶的问题

我最近做western的时候，配胶这一块很让人头疼，不管是12%还是15%的胶都分的不是很开，特别是15到10kb完全没有分开。检查了配方什么都没有问题，配胶的那套溶液也都是按照分子克隆书上的配方新配的，可不知道为什么就是分不开，以前不会这样。各位大神谁能帮帮我？你们的配方都是多少？找不到原因好郁闷的。
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1楼 2013-07-26 15:07:00
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亲爱的景景

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-07-26 15:09:23
是KD不是Kb吧，12%的胶应该没有问题的啊，你把所有配胶的buffer都换新的。

那你知道不同浓度的分离胶可以分开的蛋白的分子量的范围吗？
是否可以告知？
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3楼2013-07-26 15:40:57
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是KD不是Kb吧，12%的胶应该没有问题的啊，你把所有配胶的buffer都换新的。
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我会绕一个圈，走回到实验室
2楼2013-07-26 15:09:23
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
亲爱的景景(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-26 17:42:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by 亲爱的景景 at 2013-07-26 15:40:57
那你知道不同浓度的分离胶可以分开的蛋白的分子量的范围吗？
是否可以告知？...

百分比    KD
15   15-45
12.5   15-60
10   18-75
7.5   30-120
5   60-212
我也背不下来，网上刚查的~~我们以前一般15-60kd的都用10-12的
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我会绕一个圈，走回到实验室
4楼2013-07-26 16:38:04
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spaceman_jia

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般跑胶不用像下面这样，但低分子量的例外。
所有试剂包括电泳缓冲液都换新的，把池子也洗干净。
包括AP也要全新的，否则凝固太慢影响低分子量的聚焦。
玻璃片要去离子水洗干净擦干再用。灌胶架也要洗干净。
上样要薄，我喜欢用GelLoader枪头
电泳温度很重要，别吝惜冰块。
做得极致一点更好找到问题的原因。
以上是我的经验，在分离十几K的三条组蛋白的时候可以达到4-20%梯度胶的聚焦效果。
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6楼2013-07-27 21:20:06
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