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亲爱的景景

新虫 (初入文坛)

[求助] Western配胶的问题

我最近做western的时候,配胶这一块很让人头疼,不管是12%还是15%的胶都分的不是很开,特别是15到10kb完全没有分开。检查了配方什么都没有问题,配胶的那套溶液也都是按照分子克隆书上的配方新配的,可不知道为什么就是分不开,以前不会这样。各位大神谁能帮帮我?你们的配方都是多少?找不到原因好郁闷的。
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spaceman_jia

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般跑胶不用像下面这样,但低分子量的例外。
所有试剂包括电泳缓冲液都换新的,把池子也洗干净。
包括AP也要全新的,否则凝固太慢影响低分子量的聚焦。
玻璃片要去离子水洗干净擦干再用。灌胶架也要洗干净。
上样要薄,我喜欢用GelLoader枪头
电泳温度很重要,别吝惜冰块。
做得极致一点更好找到问题的原因。
以上是我的经验,在分离十几K的三条组蛋白的时候可以达到4-20%梯度胶的聚焦效果。
6楼2013-07-27 21:20:06
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是KD不是Kb吧,12%的胶应该没有问题的啊,你把所有配胶的buffer都换新的。
我会绕一个圈,走回到实验室
2楼2013-07-26 15:09:23
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亲爱的景景

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-07-26 15:09:23
是KD不是Kb吧,12%的胶应该没有问题的啊,你把所有配胶的buffer都换新的。

那你知道不同浓度的分离胶可以分开的蛋白的分子量的范围吗?
是否可以告知?
3楼2013-07-26 15:40:57
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


亲爱的景景(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-07-26 17:42:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by 亲爱的景景 at 2013-07-26 15:40:57
那你知道不同浓度的分离胶可以分开的蛋白的分子量的范围吗?
是否可以告知?...

百分比    KD
15   15-45
12.5   15-60
10   18-75
7.5   30-120
5   60-212
我也背不下来,网上刚查的~~我们以前一般15-60kd的都用10-12的
我会绕一个圈,走回到实验室
4楼2013-07-26 16:38:04
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