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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么做实时定量pcr？
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么做实时定量pcr？

吐槽一句：学姐什么都不懂！！

现在有某昆虫的转录组测序结果，也筛选出功能基因了。
想做定量pcr，比较功能基因在该昆虫不同龄期的表达规律。
该怎么开始？
序列有有多，我要从哪里开始试剂引物？
选TaqMan荧光探针还是SYBR荧光染料？如果用探针是不是还要设计探针啊？
选什么做内参基因？应该是要选一个在不同年龄阶段均表达稳定的基因吧。18S rRNA可以么？
还有能不能给我解释一下，外标法和外参法有什么区别、内标法，内参等等这些易混淆的概念。
谢谢。
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多少辛酸不可告人。
1楼 2013-07-25 17:05:03
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changes

木虫 (正式写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-25 20:57:16
是在不懂的话还是多看文献吧，尤其是类似的材料的qRT-PCR。

文献就是开始的第一步。

如果只是对一些基因进行不同发育期的表达谱分析，建议利用荧光染料做，当然对于非常感兴趣要进行下游其它的研究的话可以设计个TaqMan探针(此时内参基因也要利用TaqMan探针标记)。

至于内参基因的选择也是利用文献先检索吧，如果实在是没有相关文献，那么光确定一个内参基因就是一篇文章了。

其它的问题还是先看文献吧。有人认为很简单，细致起来很繁琐。
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2楼2013-07-25 20:17:41
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by changes at 2013-07-25 20:17:41
是在不懂的话还是多看文献吧，尤其是类似的材料的qRT-PCR。

文献就是开始的第一步。

如果只是对一些基因进行不同发育期的表达谱分析，建议利用荧光染料做，当然对于非常感兴趣要进行下游其它的研究的话可以设 ...

现在文献看了一些了，有点眉目了。
这些东西对我来说还是很陌生的，受启发了。谢谢。
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多少辛酸不可告人。
3楼2013-07-26 11:22:16
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biomed_fanyi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物设计可以用invitrogen的网站上那个，具体我忘了什么名字，你搜一下就应该看到。
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4楼2013-07-26 11:58:08
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biomed_fanyi at 2013-07-26 11:58:08
引物设计可以用invitrogen的网站上那个，具体我忘了什么名字，你搜一下就应该看到。

行，我去看看。
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多少辛酸不可告人。
5楼2013-07-26 13:02:04
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xwk0409

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Jianxiao_H: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-07-27 16:08:42
引物设计其实可以用在线软件primer 3.0就行。想比较不同龄期表达量只需要做个相对定量就行，用SYBR染料就行。
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6楼2013-07-26 22:45:48
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xwk0409 at 2013-07-26 22:45:48
引物设计其实可以用在线软件primer 3.0就行。想比较不同龄期表达量只需要做个相对定量就行，用SYBR染料就行。

愚以为，不同年龄的应该用绝对定量啊。
取不同年龄的昆虫做不同的实验组即可。
相对定量还得做内参基因，而该昆虫内参基因并没有确定，似乎比较麻烦。
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多少辛酸不可告人。
7楼2013-07-27 12:27:07
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yilunanxia

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-29 13:27:18
你的引物就是两对，一对是你要考核的目的基因，一个是内参、
果断SYBR Green啊，价格上的优势，而且你这个实验不需要用到TaqMan的。当然你们课题组不缺钱的话那就没啥了。我个人觉得Taqman要费事得多。
18SRNA是没问题的。
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8楼2013-08-29 11:14:00
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