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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » EHA105农杆菌转化
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yuanzou2011

新虫 (初入文坛)

[求助] EHA105农杆菌转化 已有2人参与

已经构建好的载体（测序结果正确）转化农杆菌，在LB+50mg/ml Rif(利福平) +50mg/ml Spe平板上长出，挑取单一菌落，在LB+50mg/ml Rif(利福平)+ 50mg/ml Hyo(潮霉素)+ 50mg/ml Kam(卡那霉素)的液体培养基中培养，但是培养2天都还感觉不浑浊。EHA105抗利福平和Spe，我的载体抗潮霉素和卡那霉素。就我现在的经验，分析不出问题的原因，求各位大虾们指点
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1楼 2013-07-07 22:23:36
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 学习下 2013-07-08 08:08:22
yuanzou2011: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-08 14:31:00
转化后楼主为什么不使用Rif+Spe+Kam这样组合的平板，菌株抗rif+Spe的话，只在Rif+Spe平板上你怎么确定是阳性菌落？
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-07-08 03:03:01
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yuanzou2011

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-07-08 03:03:01
转化后楼主为什么不使用Rif+Spe+Kam这样组合的平板，菌株抗rif+Spe的话，只在Rif+Spe平板上你怎么确定是阳性菌落？

那平板上还需要加Hyo吗？
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3楼2013-07-08 08:40:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuanzou2011: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-08 14:31:19
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanzou2011 at 2013-07-08 08:40:47
那平板上还需要加Hyo吗？...

平板肯定要加载体抗性的物质才能起到筛选作用啦，你用错抗性了哈
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-07-08 11:01:43
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuanzou2011: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-08 14:31:30
你涂平板和摇菌怎么不用同样的抗生素呢？
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5楼2013-07-08 11:26:45
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changes

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuanzou2011: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-08 14:31:41
EHA105只有Rif抗性和nalidixic acid抗性。Spe是什么抗性？

你的载体应该是双元载体，在农杆菌中主要是赋予菌卡那霉素的抗性。潮霉素没有表达。

阳性转化子单克隆的培养，可以利用Rif+Kan就可以了，Kan还是很好用的。
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6楼2013-07-08 12:16:22
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yuanzou2011

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by changes at 2013-07-08 12:16:22
EHA105只有Rif抗性和nalidixic acid抗性。Spe是什么抗性？

你的载体应该是双元载体，在农杆菌中主要是赋予菌卡那霉素的抗性。潮霉素没有表达。

阳性转化子单克隆的培养，可以利用Rif+Kan就可以了，Kan还是很好 ...

谢谢回复！我的载体是pGWB5，是抗卡纳和潮霉素。单克隆用液体培养基培养直接用Rif+Kam也可以吗？现在重新转化，是在Rif+Kam的平板上涂。
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7楼2013-07-08 14:29:04
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changes

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yuanzou2011 at 2013-07-08 14:29:04
谢谢回复！我的载体是pGWB5，是抗卡纳和潮霉素。单克隆用液体培养基培养直接用Rif+Kam也可以吗？现在重新转化，是在Rif+Kam的平板上涂。...

可以，筛选平板和液体培养基都是利用Rif和Kan。如果两天左右长出克隆子应该就没有问题了。
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8楼2013-07-08 14:40:59
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zl/Sophia

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我现在要制作农杆菌EHA105感受态，使用LB培养基，添加Rif 50mg/L，在28度培养，可是培养好几天了OD值始终达不到0.3~0.5，只培养农杆菌就花费了两周，是怎么回事呢？哪出了问题，请教各位前辈指点一二！也请问楼主有没有遇到这个情况！是抗生素加多了吗？
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9楼2014-08-21 10:50:00
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Oxygen_37

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by zl/Sophia at 2014-08-21 10:50:00
我现在要制作农杆菌EHA105感受态，使用LB培养基，添加Rif 50mg/L，在28度培养，可是培养好几天了OD值始终达不到0.3~0.5，只培养农杆菌就花费了两周，是怎么回事呢？哪出了问题，请教各位前辈指点一二！也请问楼主有 ...

第一种可能是菌的活力的问题 第二种是培养基PH的问题

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10楼2017-11-23 09:56:05
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