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yuanzou2011

新虫 (初入文坛)

[求助] EHA105农杆菌转化 已有2人参与

已经构建好的载体(测序结果正确)转化农杆菌,在LB+50mg/ml Rif(利福平) +50mg/ml Spe平板上长出,挑取单一菌落,在LB+50mg/ml Rif(利福平)+ 50mg/ml Hyo(潮霉素)+ 50mg/ml Kam(卡那霉素)的液体培养基中培养,但是培养2天都还感觉不浑浊。EHA105抗利福平和Spe,我的载体抗潮霉素和卡那霉素。就我现在的经验,分析不出问题的原因,求各位大虾们指点
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yuanzou2011

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by changes at 2013-07-08 12:16:22
EHA105只有Rif抗性和nalidixic acid抗性。Spe是什么抗性?

你的载体应该是双元载体,在农杆菌中主要是赋予菌卡那霉素的抗性。潮霉素没有表达。

阳性转化子单克隆的培养,可以利用Rif+Kan就可以了,Kan还是很好 ...

谢谢回复!我的载体是pGWB5,是抗卡纳和潮霉素。单克隆用液体培养基培养直接用Rif+Kam也可以吗?现在重新转化,是在Rif+Kam的平板上涂。
7楼2013-07-08 14:29:04
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 学习下 2013-07-08 08:08:22
yuanzou2011: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-08 14:31:00
转化后楼主为什么不使用Rif+Spe+Kam这样组合的平板,菌株抗rif+Spe的话,只在Rif+Spe平板上你怎么确定是阳性菌落?
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
2楼2013-07-08 03:03:01
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yuanzou2011

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-07-08 03:03:01
转化后楼主为什么不使用Rif+Spe+Kam这样组合的平板,菌株抗rif+Spe的话,只在Rif+Spe平板上你怎么确定是阳性菌落?

那平板上还需要加Hyo吗?
3楼2013-07-08 08:40:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
yuanzou2011: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-07-08 14:31:19
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanzou2011 at 2013-07-08 08:40:47
那平板上还需要加Hyo吗?...

平板肯定要加载体抗性的物质才能起到筛选作用啦,你用错抗性了哈
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-07-08 11:01:43
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