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面团中自由巯基含量测定
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我要测定面团当中的自由巯基含量。用的Ellman方法（蛋白质提取后加入DTNB显色反应，测412nm吸光度）。 这是我的操作。 按照国标方法清洗面筋，然后冷冻干燥，磨粉过筛后制备得到面筋蛋白粉末。 用10ml 8M尿素-Tris/Hcl溶液 溶解0.1g面筋，磁力搅拌1h。 10000g离心10min，取上清液1 ml 加入4ml 8M尿素-Tris/Hcl，100ul 4mg/ml DTNB. 然后就没有颜色反应。 面筋蛋白溶液加巯基乙醇和盐酸胍处理之后，用三氯乙酸沉淀蛋白，结果盐酸胍晶体析出，导致后来不加盐酸胍了（这个问题又是闹哪样！）。沉淀后的蛋白质用8M尿素溶解加DTNB有颜色反应，说明方法没问题，二硫键也存在的好好地。 问题出在哪里呢？我用半胱氨酸溶液和DTNB反应，有颜色反应，说明DTNB没问题。自由巯基容易被氧化，是在制备面筋蛋白的过程中被氧化了？还是有其他什么原因呢。我看很多中文文章都测过，很容易的样子，可是我一直没搞定。 |
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 |
7楼2015-09-29 09:06:59
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 |
8楼2015-09-29 09:07:14
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