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面团中自由巯基含量测定
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我要测定面团当中的自由巯基含量。用的Ellman方法（蛋白质提取后加入DTNB显色反应，测412nm吸光度）。 这是我的操作。 按照国标方法清洗面筋，然后冷冻干燥，磨粉过筛后制备得到面筋蛋白粉末。 用10ml 8M尿素-Tris/Hcl溶液 溶解0.1g面筋，磁力搅拌1h。 10000g离心10min，取上清液1 ml 加入4ml 8M尿素-Tris/Hcl，100ul 4mg/ml DTNB. 然后就没有颜色反应。 面筋蛋白溶液加巯基乙醇和盐酸胍处理之后，用三氯乙酸沉淀蛋白，结果盐酸胍晶体析出，导致后来不加盐酸胍了（这个问题又是闹哪样！）。沉淀后的蛋白质用8M尿素溶解加DTNB有颜色反应，说明方法没问题，二硫键也存在的好好地。 问题出在哪里呢？我用半胱氨酸溶液和DTNB反应，有颜色反应，说明DTNB没问题。自由巯基容易被氧化，是在制备面筋蛋白的过程中被氧化了？还是有其他什么原因呢。我看很多中文文章都测过，很容易的样子，可是我一直没搞定。 |
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