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1012203014

金虫 (正式写手)

99503102: 由于本贴时间较为久远,建议另开求助帖求助 2015-10-07 20:55:31
测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)
问题1:上述公式中稀释倍数D是怎么算的(具体的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1?
问题2:我测的物质为毛发固体样品,二硫键含量在350μmol/g附近,此种测试方法是否具有可行性
问题3:由于毛发样品中含有非水溶性蛋白,又没哟测量二硫键含量的更好的方法
谢谢了
奋斗!永不止步!
11楼2015-10-07 15:55:07
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1012203014

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 煜,莫烦恼 at 2013-06-28 20:46:38
处理液Tris/HCl pH问题,显色液可能要用Tris/Gly-SDS-Urea ,另外Ellman试剂也使用Tris/Gly 配,显色时间、水浴温度等,你都没提到?

测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)
问题1:上述公式中稀释倍数D是怎么算的(具体的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1?
问题2:我测的物质为毛发固体样品,二硫键含量在350μmol/g附近,此种测试方法是否具有可行性
问题3:由于毛发样品中含有非水溶性蛋白,又没哟测量二硫键含量的更好的方法
谢谢了
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12楼2015-10-07 15:55:34
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1012203014

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by loveiron at 2013-07-02 10:23:53
没有测巯基的国标吧?至少没找到。
我看中文用ellman方法的全部是这么做的(然后就假设中文没那么可信)
参考外文,《determination of SH- and SS-group in some food proteins using ellman's reagent》. 我也 ...

测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)
问题1:上述公式中稀释倍数D是怎么算的(具体的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1?
问题2:我测的物质为毛发固体样品,二硫键含量在350μmol/g附近,此种测试方法是否具有可行性
问题3:由于毛发样品中含有非水溶性蛋白,又没哟测量二硫键含量的更方法

谢谢了
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13楼2015-10-07 15:56:12
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