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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞破壁去除蛋白的方法
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)

[求助] 细胞破壁去除蛋白的方法

请教高手，打算细胞破壁后用高效液相测定胞内产物，但是考虑到蛋白太多，所以打算先去除蛋白，在检测。用2被体积的异丙醇沉淀后，去检测，却找不到我的胞内产物了。只有异丙醇的峰了。而之前我没有去除蛋白时，是有我的胞内产物的峰的。是不是异丙醇沉淀蛋白的方法不对啊 ？有没有其他可以沉淀蛋白的方法？谢谢啊
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1楼 2013-05-30 15:12:39
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是破碎细胞后，去除一些杂蛋白后再上液相吗？
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2楼2013-05-31 09:23:57
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-31 09:23:57
你是破碎细胞后，去除一些杂蛋白后再上液相吗？

嗯，是的。可能是我的目的胞内产物量比较小，破壁后2倍体积的异丙醇沉淀后，浓度太低了，所以无法检测到。请问有没有更好的去蛋白的办法？谢谢
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3楼2013-05-31 10:01:06
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xiaohong1213(myprayer代发): 金币+1, Send person rose fragrance in hand, thank you loosen one\\\'s purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-05-31 10:47:06
xiaohong1213: 金币+9, ★★★很有帮助 2013-05-31 13:39:36
1.你如何检测你的目的蛋白表达了？
2.你用的是原始菌还是重组滴啊？
3.你确定你的目的蛋白没有沉淀下来？
4.应该是先纯化你的蛋白啊？
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4楼2013-05-31 10:12:46
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-31 10:12:46
1.你如何检测你的目的蛋白表达了？
2.你用的是原始菌还是重组滴啊？
3.你确定你的目的蛋白没有沉淀下来？
4.应该是先纯化你的蛋白啊？

谢谢你如此有条理的提问。
1 目的蛋白的表达我做了SDS-PAGE。不过没测酶活。
2 液相用的是重组菌，没有问题的。
3 目的蛋白应该没有沉淀，之前用破壁上清液直接跑过液相，有产物，只是蛋白量太大，担心损坏柱子，所以打算先去一下蛋白。
4 如果要纯化蛋白该如何做呢？
非常感谢！！！
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5楼2013-05-31 12:59:48
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaohong1213 at 2013-05-31 12:59:48
谢谢你如此有条理的提问。
1 目的蛋白的表达我做了SDS-PAGE。不过没测酶活。
2 液相用的是重组菌，没有问题的。
3 目的蛋白应该没有沉淀，之前用破壁上清液直接跑过液相，有产物，只是蛋白量太大，担心损坏柱子 ...

3.我的意思是目的蛋白会不会在去除杂蛋白的时候也一起沉淀了。
4.既然是重组菌，建议加个小标签，如his，这样你就可以用镍柱纯化了。
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6楼2013-05-31 13:04:09
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
xiaohong1213: 回帖置顶 2013-05-31 13:41:48
引用回帖:
6楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-31 13:04:09
3.我的意思是目的蛋白会不会在去除杂蛋白的时候也一起沉淀了。
4.既然是重组菌，建议加个小标签，如his，这样你就可以用镍柱纯化了。...

哦，不好意思，理解错误了。不过我的胞内所测产物不是蛋白，只是因为破壁后胞内蛋白影响我跑液相，怕蛋白太多损坏柱子，所以想除去蛋白而已。用2倍体积的异丙醇沉淀蛋白做到了，却把所测产物也稀释了，峰面积特别小，几乎可以看作误差了。所以想找一种除蛋白更好的方法。可以指教一下吗？谢谢！！！
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7楼2013-05-31 13:31:23
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edoz1986

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiaohong1213 at 2013-05-31 13:31:23
哦，不好意思，理解错误了。不过我的胞内所测产物不是蛋白，只是因为破壁后胞内蛋白影响我跑液相，怕蛋白太多损坏柱子，所以想除去蛋白而已。用2倍体积的异丙醇沉淀蛋白做到了，却把所测产物也稀释了，峰面积特别小 ...

那可以试试硫酸铵沉淀法。
蛋白沉淀后，你在把样品中的硫酸铵透析出去就好了。
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8楼2013-05-31 13:57:19
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-31 13:57:19
那可以试试硫酸铵沉淀法。
蛋白沉淀后，你在把样品中的硫酸铵透析出去就好了。...

嗯嗯，好的！非常感谢！！！！
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9楼2013-05-31 14:54:11
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xiaohong1213

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xiaohong1213 at 2013-05-31 14:54:11
嗯嗯，好的！非常感谢！！！！...

你好！我想再问问你，我没用你说的硫酸铵沉淀法，因为我的样品有50个，太多，不太方便，我用苯酚氯仿抽提法抽提了蛋白，而我的目的检测物质却溶在苯酚中了，有没有既能我的样品分层并与我的样品不溶，又能沉淀蛋白的方法。谢谢！
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10楼2013-06-01 15:45:53
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