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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆，转化，全长cDNA克隆，表达目的蛋白。PMD18-
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李小冬

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆，转化，全长cDNA克隆，表达目的蛋白。PMD18-

弱弱的问一句，做真核表达，前期步骤目的片段TA克隆，正反向的连接概率是50%么？
转化，筛选纯化，挑去的白色菌落，加入液体培养基，提取质粒，按上面的方法，结果是正向的。这个结果是能说明我加入的培养基内的单个菌落都是正向，还是，只是我提取的一部分质粒是? 质粒间的互不相容性 ，在这里试用么？

谢谢
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哎呀呀
1楼2013-05-29 11:39:13
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李小冬

金虫 (小有名气)
那个上面的方法，那句话整错了，如果谁哟好的方法，也知道我一下呗。谢谢
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哎呀呀
2楼2013-05-29 11:40:25
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
李小冬(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 17:56:15
李小冬: 金币+9, ★★★很有帮助 2013-05-29 18:59:29
要做菌落PCR进行验证,验证插入片段的大小入方向的正确性.
再划线,挑单菌落PCR进行验证,然后才去摇菌，
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3楼2013-05-29 15:44:02
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不用考虑片段在T载体上的方向，设计好酶切位点，切下来装目标载体即可

理论上做TA克隆时，片段在T载体上正反向概率是50%，实际上可能不是，我经常碰到要么都是正向，要么都是反向的情况
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李小冬
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-05-29 17:58:53
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李小冬

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-29 17:58:53
不用考虑片段在T载体上的方向，设计好酶切位点，切下来装目标载体即可

理论上做TA克隆时，片段在T载体上正反向概率是50%，实际上可能不是，我经常碰到要么都是正向，要么都是反向的情况

不好意思，我才发现童虫只能回帖评分一次？
那也就是，我按2楼的方法，然后验证方向，就可以继续往下做呗？
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哎呀呀
5楼2013-05-29 19:03:43
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
5楼: Originally posted by 李小冬 at 2013-05-29 19:03:43
不好意思，我才发现童虫只能回帖评分一次？
那也就是，我按2楼的方法，然后验证方向，就可以继续往下做呗？...

方向在你设计酶切位点的就定下来了，只要你测序后序列没有问题，就可以往下面做了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-05-29 19:23:19
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