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李小冬

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆,转化,全长cDNA克隆,表达目的蛋白。PMD18-

弱弱的问一句,做真核表达,前期步骤目的片段TA克隆,正反向的连接概率是50%么?
转化,筛选纯化,挑去的白色菌落,加入液体培养基,提取质粒,按上面的方法,结果是正向的。这个结果是能说明我加入的培养基内的单个菌落都是正向,还是,只是我提取的一部分质粒是? 质粒间的互不相容性 ,在这里试用么?

谢谢
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哎呀呀
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不用考虑片段在T载体上的方向,设计好酶切位点,切下来装目标载体即可

理论上做TA克隆时,片段在T载体上正反向概率是50%,实际上可能不是,我经常碰到要么都是正向,要么都是反向的情况

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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-05-29 17:58:53
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查看全部 6 个回答

李小冬

金虫 (小有名气)

那个上面的方法,那句话整错了,如果谁哟好的方法,也知道我一下呗。谢谢
哎呀呀
2楼2013-05-29 11:40:25
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liyu0355

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
李小冬(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-29 17:56:15
李小冬: 金币+9, ★★★很有帮助 2013-05-29 18:59:29
要做菌落PCR进行验证,验证插入片段的大小入方向的正确性.
再划线,挑单菌落PCR进行验证,然后才去摇菌,
3楼2013-05-29 15:44:02
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李小冬

金虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-05-29 17:58:53
不用考虑片段在T载体上的方向,设计好酶切位点,切下来装目标载体即可

理论上做TA克隆时,片段在T载体上正反向概率是50%,实际上可能不是,我经常碰到要么都是正向,要么都是反向的情况

不好意思,我才发现童虫只能回帖评分一次?
那也就是,我按2楼的方法,然后验证方向,就可以继续往下做呗?
哎呀呀
5楼2013-05-29 19:03:43
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