24小时热门版块排行榜    

查看: 1070  |  回复: 9

小果冻524

新虫 (小有名气)

[求助] DGGE 切胶溶胶问题

以前一直做DGGE,切胶后也不捣碎,直接加30ul水溶了立即做PCR,效果都很好;但是从三月底开始切胶后一直做不出PCR,有时候能出来也有很多拖尾,一直到现在我试了琼脂糖胶的试剂盒回收,试了捣碎煮沸和水浴各种方法,都不理想,都两个月了切胶一直不能溶不出模板来,我都快崩溃了,不知道问题到底出现在哪里!!用的GELRED染色,梯度35%-65%,扩增长度400多不到500bp,以前超好的我都没想到过溶胶也会容不出来的,现在收到了巨大的打击!!请大家帮我分析下吧!感谢感谢!!
DGGE 切胶溶胶问题
3.15.jpg  这个是以前做的好的时候的溶胶后PCR图


DGGE 切胶溶胶问题-1
4.10.jpg 这个就是后来的差的
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
捣碎后加入30uL水,4℃冰箱过夜,即可。
原因可能有多重,先试试的调整下PCR体系,先从加入的DNA模版量开始,0.1微升-5微生物,选择几个梯度试一下。然后最好换下pcr试剂。
2楼2013-05-20 18:01:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wubingqi at 2013-05-20 18:01:27
捣碎后加入30uL水,4℃冰箱过夜,即可。
原因可能有多重,先试试的调整下PCR体系,先从加入的DNA模版量开始,0.1微升-5微生物,选择几个梯度试一下。然后最好换下pcr试剂。

首先谢谢你的回复,然后我觉得跟PCR体系和程序没有关系,因为用之前的溶胶液做PCR都是很好的,我觉得还是溶胶没溶出DNA,有时候行有时候不行,大部分不行
3楼2013-05-20 21:10:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小果冻524: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2013-05-28 10:14:02
加水后4℃过夜或多泡几天,一般都能洗脱,如果没有,可能就是切胶的时候紫外照射时间太长,DNA被照段了~
4楼2013-05-20 21:37:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lhf903 at 2013-05-20 21:37:58
加水后4℃过夜或多泡几天,一般都能洗脱,如果没有,可能就是切胶的时候紫外照射时间太长,DNA被照段了~

照紫外线的时间我现在也有注意了,现在都切得很快,一般溶胶超过2天的没出来我就放弃它了,明天再试试还放在4℃的胶液行不行吧!以前加水后马上做都很成功,现在真是让人抓狂啊
5楼2013-05-20 22:33:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liugs

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

6楼2013-05-21 07:59:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小果冻524 at 2013-05-20 21:10:35
首先谢谢你的回复,然后我觉得跟PCR体系和程序没有关系,因为用之前的溶胶液做PCR都是很好的,我觉得还是溶胶没溶出DNA,有时候行有时候不行,大部分不行...

析出的DNA浓度不同,自然模版的量要不同了。之前我实验室做这个的时候,我取1ul模版效果就很好,但是我同学的需要5ul模版才能扩增出来。只是建议楼主试试。另外,如果拖尾,3种情况比较常见,一是模版浓度过高,二是加的taq酶过多,三是电泳时候电压过大。
7楼2013-05-21 08:51:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by wubingqi at 2013-05-21 08:51:28
析出的DNA浓度不同,自然模版的量要不同了。之前我实验室做这个的时候,我取1ul模版效果就很好,但是我同学的需要5ul模版才能扩增出来。只是建议楼主试试。另外,如果拖尾,3种情况比较常见,一是模版浓度过高,二 ...

嗯好的,我再去试试
8楼2013-05-21 09:51:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

皮卡丘要玩耍

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我每次都是用TE 缓冲液泡胶的
9楼2013-05-21 16:05:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robinlw

新虫 (初入文坛)

出现过类似的问题,建议lz用好一点的taq酶,我换了exTAQ就解决了,其实溶胶倒不是大问题
我们的做法一般是:切下的胶捣碎后加入1×TE溶解,-20℃过夜冻融,直接取1ul用作模板做扩增
10楼2013-11-19 14:51:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小果冻524 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 考研调剂 +4 呼呼?~+123456 2026-03-24 4/200 2026-03-24 23:16 by barlinike
[考研] 300求调剂,材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +18 chaojifeixia 2026-03-19 20/1000 2026-03-24 10:34 by dolphin_ycj
[考研] 344求调剂 +3 desto 2026-03-24 3/150 2026-03-24 10:09 by 搏击518
[考博] 26申博自荐 +3 whh869393 2026-03-24 3/150 2026-03-24 09:55 by 21018060
[考研] 291求调剂 +8 hhhhxn.. 2026-03-23 8/400 2026-03-23 23:15 by peike
[考研] 284求调剂 +3 yanzhixue111 2026-03-23 6/300 2026-03-23 22:58 by pswait
[考研] 327求调剂 +5 prayer13 2026-03-23 5/250 2026-03-23 22:11 by 星空星月
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 306求调剂 +9 chuanzhu川烛 2026-03-18 9/450 2026-03-23 13:17 by luoyongfeng
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +8 tcxiaoxx 2026-03-20 9/450 2026-03-23 12:16 by tcxiaoxx
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:12 by 朱芷琳
[考研] 269专硕求调剂 +6 金恩贝 2026-03-21 6/300 2026-03-22 14:31 by ColorlessPI
[考博] 招收博士1-2人 +3 QGZDSYS 2026-03-18 4/200 2026-03-22 10:25 by QGZDSYS
[基金申请] 山东省面上项目限额评审 +4 石瑞0426 2026-03-19 4/200 2026-03-22 08:50 by Wei_ren
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 一志愿苏州大学材料求调剂,总分315(英一) +5 sbdksD 2026-03-19 5/250 2026-03-20 22:10 by luoyongfeng
[考研] 290求调剂 +7 ^O^乜 2026-03-19 7/350 2026-03-20 21:43 by JourneyLucky
[考研] 一志愿吉林大学材料学硕321求调剂 +11 Ymlll 2026-03-18 15/750 2026-03-20 19:40 by 丁丁*
[考研] 085410人工智能专硕317求调剂(0854都可以) +4 xbxudjdn 2026-03-18 4/200 2026-03-20 09:07 by 不168
信息提示
请填处理意见