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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » DGGE 切胶溶胶问题
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小果冻524

新虫 (小有名气)

[求助] DGGE 切胶溶胶问题

以前一直做DGGE，切胶后也不捣碎，直接加30ul水溶了立即做PCR，效果都很好；但是从三月底开始切胶后一直做不出PCR，有时候能出来也有很多拖尾，一直到现在我试了琼脂糖胶的试剂盒回收，试了捣碎煮沸和水浴各种方法，都不理想，都两个月了切胶一直不能溶不出模板来，我都快崩溃了，不知道问题到底出现在哪里！！用的GELRED染色，梯度35%-65%，扩增长度400多不到500bp，以前超好的我都没想到过溶胶也会容不出来的，现在收到了巨大的打击！！请大家帮我分析下吧！感谢感谢！！
DGGE 切胶溶胶问题
3.15.jpg  这个是以前做的好的时候的溶胶后PCR图


DGGE 切胶溶胶问题-1
4.10.jpg 这个就是后来的差的
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1楼 2013-05-20 16:25:53
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wubingqi

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
捣碎后加入30uL水，4℃冰箱过夜，即可。
原因可能有多重，先试试的调整下PCR体系，先从加入的DNA模版量开始，0.1微升-5微生物，选择几个梯度试一下。然后最好换下pcr试剂。
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2楼2013-05-20 18:01:27
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wubingqi at 2013-05-20 18:01:27
捣碎后加入30uL水，4℃冰箱过夜，即可。
原因可能有多重，先试试的调整下PCR体系，先从加入的DNA模版量开始，0.1微升-5微生物，选择几个梯度试一下。然后最好换下pcr试剂。

首先谢谢你的回复，然后我觉得跟PCR体系和程序没有关系，因为用之前的溶胶液做PCR都是很好的，我觉得还是溶胶没溶出DNA，有时候行有时候不行，大部分不行
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3楼2013-05-20 21:10:35
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小果冻524: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2013-05-28 10:14:02
加水后4℃过夜或多泡几天，一般都能洗脱，如果没有，可能就是切胶的时候紫外照射时间太长，DNA被照段了~
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4楼2013-05-20 21:37:58
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lhf903 at 2013-05-20 21:37:58
加水后4℃过夜或多泡几天，一般都能洗脱，如果没有，可能就是切胶的时候紫外照射时间太长，DNA被照段了~

照紫外线的时间我现在也有注意了，现在都切得很快，一般溶胶超过2天的没出来我就放弃它了，明天再试试还放在4℃的胶液行不行吧！以前加水后马上做都很成功，现在真是让人抓狂啊
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5楼2013-05-20 22:33:03
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liugs

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2013-05-21 07:59:36
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wubingqi

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小果冻524 at 2013-05-20 21:10:35
首先谢谢你的回复，然后我觉得跟PCR体系和程序没有关系，因为用之前的溶胶液做PCR都是很好的，我觉得还是溶胶没溶出DNA，有时候行有时候不行，大部分不行...

析出的DNA浓度不同，自然模版的量要不同了。之前我实验室做这个的时候，我取1ul模版效果就很好，但是我同学的需要5ul模版才能扩增出来。只是建议楼主试试。另外，如果拖尾，3种情况比较常见，一是模版浓度过高，二是加的taq酶过多，三是电泳时候电压过大。
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7楼2013-05-21 08:51:28
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wubingqi at 2013-05-21 08:51:28
析出的DNA浓度不同，自然模版的量要不同了。之前我实验室做这个的时候，我取1ul模版效果就很好，但是我同学的需要5ul模版才能扩增出来。只是建议楼主试试。另外，如果拖尾，3种情况比较常见，一是模版浓度过高，二 ...

嗯好的，我再去试试
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8楼2013-05-21 09:51:00
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皮卡丘要玩耍

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我每次都是用TE 缓冲液泡胶的
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9楼2013-05-21 16:05:51
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robinlw

新虫 (初入文坛)
出现过类似的问题，建议lz用好一点的taq酶，我换了exTAQ就解决了，其实溶胶倒不是大问题
我们的做法一般是：切下的胶捣碎后加入1×TE溶解，-20℃过夜冻融，直接取1ul用作模板做扩增
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10楼2013-11-19 14:51:21
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