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哆啦B梦1024

铜虫 (小有名气)

[求助] 纯化后蛋白没活性，试过很多方法都不行啊~~~

各位亲爱的虫友，我过镍柱纯化蛋白，之前出现的问题是冷冻干燥后的蛋白粉末不溶，尝试透析后不冻干成粉末，直接在溶液里，然后浓缩了一下，发现还是没有活性。在网上看见有说纯化后蛋白里面如果有核酸要用DNA酶去掉，但是我不太明白核酸的存在会对酶活有影响吗？是什么原理啊？另外，我准备把组氨酸标签用凝血酶去掉，想再试一下这个~  各位虫友有啥经验不吝赐教啊！（在做这个的同时已经准备换载体了，用PET22b（+）……）
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1楼 2013-05-09 14:26:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

核酸影响对酶活性的原理参考：【荷兰】曹荻秋(Linqiu Cao) 著，杨晟、袁中一 译，载体固定化酶----原理、应用和设计，化学工业出版社，2008，我借鉴了酶的固定化介质对已酶活性的影响，在叙述上我结合酶学原理做了少量补充，把酶的固定化介质对已酶活性的影响的原理应用到核酸对酶的活性影响上，如此应用的理论基础是酶的催化原理，后者我就不列出文献了。----------你要的话，可以告诉你。
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3楼2013-05-09 16:37:31
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
哆啦B梦1024(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-09 20:52:23
那你在(his)6与目的蛋白质之间构建一个5个亲水氨基酸构成的酶的切点吧，比如凝血酶的专一性切点，然后过柱时用凝血酶的洗脱液切断(his)6标签进行纯化吧。
核酸影响对酶活性很正常，两者形成了非共价的聚集体的话，使得酶的构象僵化，进而使酶的诱导契合会受限制甚至不可能；酶的底物通道会被核酸堵住使底物无法接近酶；核酸线状亲水长链分子，与酶结合后会改变酶的分子表面的微环境-----包括活性中心附近的微环境。
要去掉核酸，可用阴离子交换色谱柱。
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2楼2013-05-09 15:41:26
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