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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平板能长，挑单克隆却不长啊啊啊啊啊
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Francis_zw

铜虫 (初入文坛)

[求助] 平板能长，挑单克隆却不长啊啊啊啊啊

小弟刚做的转化，平板长的很好，挑取单克隆到5ml LB中培养，长势不错，但后几次却不行（一个礼拜内），后有虫友说是杂菌污染了平板，那么我再次把上次做转化的EP管拿出来取100ul 涂布在Amp 100ug/ml的平板上（调大筛选压力），待平板长好后，昨天晚上挑单克隆到5ml  LB 中，今天早上还是澄清，我晕，出了鬼了，这是？~
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1楼 2013-05-04 16:27:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-05-04 19:56:47
建议重新做一下转化，因为转化之后的菌保存较长时间里面的质粒可能会丢失！
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做实验就是和上帝玩游戏！
2楼2013-05-04 19:53:34
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-27 17:01:09
我一般用150的Amp浓度，而且Amp容易失活，平板最好不要放置时间太长。如你所述，涂板得到的克隆没有用菌落PCR或者普通PCR进行验证么？容易出现假阳性的克隆。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
5楼2013-05-05 13:04:31
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-27 17:00:58
转化时做负对照，不加DNA的感受态，熱激、复苏后涂抗amp板子，如果长菌落，说明抗性板的筛选压力不够。
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3楼2013-05-05 02:59:36
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Francis_zw

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by senix at 2013-05-04 19:53:34
建议重新做一下转化，因为转化之后的菌保存较长时间里面的质粒可能会丢失！

才3-4天的事情呀，应该没这么快吧，我的Amp筛选压力已经提到100ug/ml了。
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4楼2013-05-05 12:13:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-05 21:01:05
是不是LB的问题，重新配置一下；Amp失活后引起杂菌生长也可能是一个因素。
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6楼2013-05-05 14:35:21
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Francis_zw

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2013-05-05 13:04:31
我一般用150的Amp浓度，而且Amp容易失活，平板最好不要放置时间太长。如你所述，涂板得到的克隆没有用菌落PCR或者普通PCR进行验证么？容易出现假阳性的克隆。

我是接手师兄做的，我并不知道质粒的确切信息，故难以做PCR鉴定，哎
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7楼2013-05-06 13:48:44
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Francis_zw

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-05 14:35:21
是不是LB的问题，重新配置一下；Amp失活后引起杂菌生长也可能是一个因素。

Amp没有问题，我后来知道应该是冷冻的LB的问题，单克隆被杀死。
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8楼2013-05-06 13:49:44
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mao877516786

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Francis_zw at 2013-05-06 13:49:44
Amp没有问题，我后来知道应该是冷冻的LB的问题，单克隆被杀死。...

很好奇在平板上长了一段时间的单克隆，怎么会被培养基杀死，你培养基里加了什么东西么
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9楼2013-05-07 13:39:11
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sxxuan

金虫 (著名写手)
一开始长得不错的时候，菌株有没有保存？
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你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2013-05-07 16:13:20
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