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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 好不容易得到的单克隆莫名其妙的没了
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desheng101

木虫 (正式写手)

[交流] 好不容易得到的单克隆莫名其妙的没了 已有3人参与

花了几个月的时间做酶切连接，终于有一线希望。有单克隆挑取酶切鉴定测序基本能确定就是了。昨天把单克隆的菌质粒重新提取一下准备下一步，双酶切怎么也切不出来2条带，我真是无语了，以前能切出来，现在就一条带，貌似是载体的条带。实在不知道什么原因
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1楼 2012-12-31 22:43:37
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wxf-er

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
切不出来很正常，另外你提供的信息太少了，不好判断，给你说下可能的原因和验证方式。有很多原因造成酶切不出来：1.假阳性；2.确定有没转进去，可以先尝试做菌液PCR（挑单克隆后摇菌培养，用菌液直接做模板），做好对照。3.阳性PCR的菌液，再提质粒跑胶检测大小是否正确。4.酶切吧，做阴阳对照最好。如果前3步骤都正确，或者菌液PCR有阳性，可以先去测序验证，至于最后酶切--------
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自然
2楼2013-01-01 01:59:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用单酶切看一下质粒大小是不是对。此外，你的插入片段多大？可以看到载体大小片段，是不是小片段太暗没看清啊。做酶切的时候你是否做了载体酶切对照？确定得到的片段和载体一样大吗？会不会是有一个酶没起作用呢？
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3楼2013-01-01 03:22:14
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ccharlien

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你不是有原来测序正确的质粒么
重新转进去就可以了 也不麻烦
长期保存还是保存质粒
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4楼2013-01-03 03:33:15
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