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desheng101

木虫 (正式写手)

[交流] 好不容易得到的单克隆莫名其妙的没了 已有3人参与

花了几个月的时间做酶切连接,终于有一线希望。有单克隆挑取酶切鉴定测序基本能确定就是了。昨天把单克隆的菌质粒重新提取一下准备下一步,双酶切怎么也切不出来2条带,我真是无语了,以前能切出来,现在就一条带,貌似是载体的条带。实在不知道什么原因
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
用单酶切看一下质粒大小是不是对。此外,你的插入片段多大?可以看到载体大小片段,是不是小片段太暗没看清啊。做酶切的时候你是否做了载体酶切对照?确定得到的片段和载体一样大吗?会不会是有一个酶没起作用呢?
3楼2013-01-01 03:22:14
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wxf-er

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
切不出来很正常,另外你提供的信息太少了,不好判断,给你说下可能的原因和验证方式。有很多原因造成酶切不出来:1.假阳性;2.确定有没转进去,可以先尝试做菌液PCR(挑单克隆后摇菌培养,用菌液直接做模板),做好对照。3.阳性PCR的菌液,再提质粒跑胶检测大小是否正确。4.酶切吧,做阴阳对照最好。如果前3步骤都正确,或者菌液PCR有阳性,可以先去测序验证,至于最后酶切--------
自然
2楼2013-01-01 01:59:43
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ccharlien

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你不是有原来测序正确的质粒么
重新转进去就可以了 也不麻烦
长期保存还是保存质粒
4楼2013-01-03 03:33:15
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