| 查看: 2623 | 回复: 6 | |||
gqww2金虫 (小有名气)
|
[交流]
做PCR，如何选取引物？请大家指导 已有6人参与
|
| 想做PCR，之前没有做过，关于引物的选择，应该怎么选，请大家指点？ |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急
已经有7人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有3人回复
-
明天应该可查了！？
已经有5人回复
-
如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》
已经有7人回复
-
没有任何消息-是不是就凉了
已经有8人回复
-
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有3人回复
-
人气不行了
已经有10人回复
-
我面上完蛋了
已经有10人回复
-
能否退出参与的面上项目解除限项
已经有24人回复
-
filecode，4个jtjc了
已经有17人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- QPCR之引物设计(二)
已经有10人回复
- 急！PCR产物测序找不到引物
已经有17人回复
- 水稻RT -PCR引物设计
已经有7人回复
- RT-PCR引物稀释问题，欢迎战友们进来指导！急盼中
已经有16人回复
- PCR引物设计求助
已经有6人回复
- 大家做pcr的酶引物 模板从冰箱里拿出来是怎么融化的啊
已经有20人回复
- 大家做RT-qPCR设计引物用的什么软件呀？
已经有15人回复
- 水体中微生物群落多样性分析
已经有8人回复
- 嵌套PCR引物如何设计？目的片段434bp
已经有6人回复
- 土壤真菌PCR-DGGE中真菌ITS区引物的选择
已经有10人回复
- PCR引物的量如何确定，求助高手指教
已经有11人回复
- realtimePCR引物
已经有11人回复
- PCR引物设计的问题
已经有8人回复
- 求高手指导，用软件设计PCR引物
已经有5人回复
- 两种引物的PCR电泳图，做了多次还是不解
已经有18人回复
- PCR最短可以P多少bp，求大家帮我设计引物！
已经有7人回复
- 如何设计重叠延伸PCR引物
已经有14人回复
- 【求助/交流】引物设计信息如此，touchdownPCR如何设计？
已经有7人回复
- 【求助/交流】pCR引物设计的详细规则
已经有7人回复
- 【求助/交流】多重PCR引物设计
已经有14人回复
2楼2013-04-14 06:56:45
yilunanxia
金虫 (正式写手)
- 应助: 37 (小学生)
- 金币: 816.9
- 散金: 269
- 红花: 2
- 帖子: 334
- 在线: 352.3小时
- 虫号: 1797048
- 注册: 2012-05-05
- 专业: 环境微生物学
3楼2013-04-14 09:03:43
 |
4楼2013-04-14 15:41:42
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
| PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3′端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。 在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 |
5楼2013-04-15 15:41:45
tianchi2952
铜虫 (小有名气)
- 应助: 32 (小学生)
- 金币: 148.1
- 帖子: 122
- 在线: 34.6小时
- 虫号: 2181828
- 注册: 2012-12-12
- 专业: 微生物遗传育种学
6楼2013-04-17 13:39:59
7楼2013-05-19 19:03:05
20