| 查看: 699 | 回复: 1 | ||
[求助]
关于荧光定量的疑问，请教论坛虫友
|
|
我是刚接触荧光定量，现在要做处理组相对于对照组基因表达的差异实验。实验有一步比较迷惑，请教这方面的虫友 我做的是相对定量（染料法），理论看了一大堆，我想问一下具体操作的时候处理组pcr管中加入的模板量需要和对照组中加入的模板量一样吗（注意不是说的目的基因pcr管中的总模板量需要和内参的一样，这个需要一样我知道，因为这样才能用内参的来normalized目的基因）？我看一些资料说做之前需要先测定一下cDNA的浓度，尽量二者的浓度一致较好，我的理解是既然有内参进行normalized，为什么还需要这一步呢，有懂得虫友吗？请教一下。百度里面一些解释说不用，但又说尽量差异不要太大，也没有解释原因，真纠结 |
回复此楼» 猜你喜欢
氢氧化钾活化操作
已经有19人回复
-
散金
已经有68人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有197人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
-
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点
已经有0人回复
-
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于实时荧光定量引物设计
已经有5人回复
- 虫友们，有没有做过食品中钠元素的测定？
已经有10人回复
- 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？
已经有21人回复
- 荧光定量PCR ，条件优化
已经有13人回复
- 有做过荧光定量PCR的吗？
已经有9人回复
- 荧光定量PCR实验技术
已经有15人回复
- 荧光定量PCR里的酶活化的小疑问
已经有6人回复
- 荧光定量sybrgreen染料荧光值大小的问题
已经有8人回复
- 荧光定量PCR。。。求助求助
已经有17人回复
- 文章中荧光定量图怎么贴上去的
已经有8人回复
- 实时荧光定量的数据导出后怎么处理啊？
已经有17人回复
- 荧光定量问题
已经有4人回复
- 荧光定量试剂哪个公司的好啊?
已经有10人回复
- 荧光定量PCR与普通PCR产物不一样？
已经有6人回复
- 【求助/交流】关于做荧光定量pcr的模板问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于荧光定量PCR中cdna合成的问题
已经有12人回复
【答案】应助回帖
|
我自己找qPCR融解曲线找到你这个贴子，我不知道你搞清楚没 先回答如下吧： 如果你的引物在你所用的反应体系中扩增效率是100%，那么模板量没必要加的完全一样，甚至可以有大至数量级的差异 但是，实际情况是你的PCR反应体系一般不是100%，会有10%-20%甚至更大的偏差，这时，如果计算相对表达量时加入引物扩增效率的校正，模板一样可以有较大差异。但是如果计算时没进行校正，或者你根本就没做引物扩增效率的预实验，建议你尽量把模板加的比较一致吧（因为进行反转时也要测定RNA含量才进行反转，所以没必要再对反转后的产物进行测定，只需同样倍数的稀释就行了）。 顺便问个问题，哪位虫友清楚一般qPCR产物的融解曲线在哪个温度范围出峰？会不会低于80度？ |
2楼2013-08-12 19:17:14
