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关于荧光定量的疑问，请教论坛虫友
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我是刚接触荧光定量，现在要做处理组相对于对照组基因表达的差异实验。实验有一步比较迷惑，请教这方面的虫友 我做的是相对定量（染料法），理论看了一大堆，我想问一下具体操作的时候处理组pcr管中加入的模板量需要和对照组中加入的模板量一样吗（注意不是说的目的基因pcr管中的总模板量需要和内参的一样，这个需要一样我知道，因为这样才能用内参的来normalized目的基因）？我看一些资料说做之前需要先测定一下cDNA的浓度，尽量二者的浓度一致较好，我的理解是既然有内参进行normalized，为什么还需要这一步呢，有懂得虫友吗？请教一下。百度里面一些解释说不用，但又说尽量差异不要太大，也没有解释原因，真纠结 |
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【答案】应助回帖
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我自己找qPCR融解曲线找到你这个贴子，我不知道你搞清楚没 先回答如下吧： 如果你的引物在你所用的反应体系中扩增效率是100%，那么模板量没必要加的完全一样，甚至可以有大至数量级的差异 但是，实际情况是你的PCR反应体系一般不是100%，会有10%-20%甚至更大的偏差，这时，如果计算相对表达量时加入引物扩增效率的校正，模板一样可以有较大差异。但是如果计算时没进行校正，或者你根本就没做引物扩增效率的预实验，建议你尽量把模板加的比较一致吧（因为进行反转时也要测定RNA含量才进行反转，所以没必要再对反转后的产物进行测定，只需同样倍数的稀释就行了）。 顺便问个问题，哪位虫友清楚一般qPCR产物的融解曲线在哪个温度范围出峰？会不会低于80度？ |
2楼2013-08-12 19:17:14
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