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草山残梦

新虫 (小有名气)

[求助] 请教实时荧光定量PCR的步骤

请教实时荧光定量PCR的步骤，本小虫预用荧光定量分析菌群动态变化，可不知道操作起来具体步骤，该注意哪些问题？谢谢啦
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1楼 2013-03-27 11:45:16
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phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
草山残梦: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-30 22:17:56
多在论坛里搜搜，上传过的系统教程很多的，下载来好好看看。
不然这么简单的一行字，别人要用多大的篇幅来回答你啊
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2楼2013-03-27 12:06:13
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shangming

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:35:55
半定量和实时定量PCR步骤
实验原理：
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
实验步骤：
Trizol法RNA提取步骤
1、提取总RNA         2、逆转录反应             3、PCR反应
以下实验步骤仅供参考：
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度   成分
0.4M   MOPS，pH 7.0
0.1M   乙酸钠
0.01M  EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
①        反应体系
序号        反应物        剂量        序号        反应物        剂量
1        逆转录buffer        2μl        5        逆转录MMLV        0.5μl
2        上游引物        0.2μl        6        DEPC水        5μl
3        下游引物        0.2μl        7        RNA模版        2μl
4        dNTP        0.1μl        8        总体积        10μl


轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②        反应体系如下：标准品反应体系
序号        反应物        剂量        序号        反应物        剂量
1        SYBR Green 1 染料        10μl        5        Taq酶        1μl
2        阳性模板上游引物F        0.5μl        6        阳性模板DNA        5μl
3        阳性模板下游引物R        0.5μl        7        ddH2O        32.5μl
4        dNTP        0.5μl        8        总体积        50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
序号        反应物        剂量        序号        反应物        剂量
1        SYBR Green 1 染料        10μl        5        Taq酶        1μl
2        内参照上游引物F        0.5μl        6         待测样品cDNA        5μl
3        内参照下游引物R        0.5μl        7        ddH2O        32.5μl
4        dNTP        0.5μl        8        总体积        50μl


轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号        反应物        剂量        序号        反应物        剂量
1        10× PCR缓冲液        2.5 ul        5        dNTP混合液        3μl
2        MgCl2 溶液        1.5μl        6        Taq酶        1μl
3        上游引物F        0.5μl        7         cDNA         1μl
4        下游引物R        0.5μl        8        加水至总体积为        25μl


轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72oC延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6 待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
序号        反应物        剂量        序号        反应物        剂量
1        SYBR Green 1 染料        10μl        5        Taq酶        2μl
2        上游引物F        1μl        6         待测样品cDNA        5μl
3        下游引物R        1μl        7        ddH2O         30μl
4        dNTP        1μl        8        总体积         50μl


轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
7 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。


PCR实验步骤
一、组织抽提：

1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2.移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
3.移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
4.冰上孵育5分钟
5.离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
6.加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟
7.离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管
8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟
9.离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液
10.加入1 ml 75%乙醇，震荡
11. 离心<7,500g, 4℃,5分钟 弃去上清液
12.室温下使之变透明
13.加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）
14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度

二、RT反应体系
RT反应体系（第一步）：约20分钟

RNA抽提物        5μl
Radome 引物      2μl
RNA sin          0.5μl
1.       65℃ 15分钟
2.       立即放入冰浴
RT反应体系（第二步）：约2小时
RNA sin          0.5μl
10mM dNTP        1μl
5×RT 缓冲液     4μl
25mM MgCl2       4μl
AMV 逆转录酶     3μl
1. 37℃ 1.5小时
2. 94℃ 5-10分钟
3.反应物保存于-20℃或进行PCR


三PCR反应体系
1)、PCR反应体系：约4.5小时

25mM MgCl2                2μl
10×PCR 缓冲液            5μl
10mM dNTP                 1μl
上下游引物10pmol/μl      2.5μl×2
CDNA模板       2.5μl
ddH2O           34μl
Taq酶          0.5μl
轻质石蜡油      50μl        100μl
1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环
3.72℃ 10分钟
4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

2)、PCR反应体系：约5小时

25mM MgCl2      3μl
10×PCR 缓冲液      5μl
10mM dNTP           1μl
上下游引物10pmol/μl        2.5μl×2
CDNA模板         5μl
ddH2O          30μl
Taq酶          1μl
轻质石蜡油         50μl        100μl
1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环
3. 72℃ 10分钟
4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

四、电泳：约1.25小时

1. 配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml
2.胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）
3.微波炉中火2分钟溶解胶
4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）
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3楼2013-03-27 13:41:58
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