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草山残梦新虫 (小有名气)
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请教实时荧光定量PCR的步骤
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| 请教实时荧光定量PCR的步骤，本小虫预用荧光定量分析菌群动态变化，可不知道操作起来具体步骤，该注意哪些问题？谢谢啦 |
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2楼2013-03-27 12:06:13
shangming
铜虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:35:55
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半定量和实时定量PCR步骤 实验原理： RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 实验步骤： Trizol法RNA提取步骤 1、提取总RNA 2、逆转录反应 3、PCR反应 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度 成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ②准备RNA样品 取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 ③电泳 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。 ④紫外透射光下观察并拍照 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3样品cDNA合成 ① 反应体系 序号 反应物 剂量 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 5 逆转录MMLV 0.5μl 2 上游引物 0.2μl 6 DEPC水 5μl 3 下游引物 0.2μl 7 RNA模版 2μl 4 dNTP 0.1μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。 ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。 4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR ①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 ② 反应体系如下：标准品反应体系 序号 反应物 剂量 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 5 Taq酶 1μl 2 阳性模板上游引物F 0.5μl 6 阳性模板DNA 5μl 3 阳性模板下游引物R 0.5μl 7 ddH2O 32.5μl 4 dNTP 0.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 5 Taq酶 1μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 6 待测样品cDNA 5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 7 ddH2O 32.5μl 4 dNTP 0.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 反应体系： 序号 反应物 剂量 序号 反应物 剂量 1 10× PCR缓冲液 2.5 ul 5 dNTP混合液 3μl 2 MgCl2 溶液 1.5μl 6 Taq酶 1μl 3 上游引物F 0.5μl 7 cDNA 1μl 4 下游引物R 0.5μl 8 加水至总体积为 25μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72oC延伸5分钟。 ②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 6 待测样品的待测基因实时定量PCR ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 体系配置如下： 序号 反应物 剂量 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 5 Taq酶 2μl 2 上游引物F 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 3 下游引物R 1μl 7 ddH2O 30μl 4 dNTP 1μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。 7 实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 PCR实验步骤 一、组织抽提： 1.取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末 2.移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆 3.移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打 4.冰上孵育5分钟 5.离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管 6.加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟 7.离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管 8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟 9.离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液 10.加入1 ml 75%乙醇，震荡 11. 离心<7,500g, 4℃,5分钟 弃去上清液 12.室温下使之变透明 13.加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱） 14.走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度 二、RT反应体系 RT反应体系（第一步）：约20分钟 RNA抽提物 5μl Radome 引物 2μl RNA sin 0.5μl 1. 65℃ 15分钟 2. 立即放入冰浴 RT反应体系（第二步）：约2小时 RNA sin 0.5μl 10mM dNTP 1μl 5×RT 缓冲液 4μl 25mM MgCl2 4μl AMV 逆转录酶 3μl 1. 37℃ 1.5小时 2. 94℃ 5-10分钟 3.反应物保存于-20℃或进行PCR 三PCR反应体系 1)、PCR反应体系：约4.5小时 25mM MgCl2 2μl 10×PCR 缓冲液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 2.5μl ddH2O 34μl Taq酶 0.5μl 轻质石蜡油 50μl 100μl 1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环 2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环 3.72℃ 10分钟 4.取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳 2)、PCR反应体系：约5小时 25mM MgCl2 3μl 10×PCR 缓冲液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 5μl ddH2O 30μl Taq酶 1μl 轻质石蜡油 50μl 100μl 1.94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环 2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环 3. 72℃ 10分钟 4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳 四、电泳：约1.25小时 1. 配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml 2.胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶） 3.微波炉中火2分钟溶解胶 4.冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml） |
3楼2013-03-27 13:41:58
