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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达重组表达载体的连问题
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新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达重组表达载体的连问题

各位朋友大家好，我最近正在做原核表达一种蛋白，目的片段大小为489bp，用内切酶ECOR1和XHO1,连接到表达载体PET28-A.双酶切质粒和目的片段转化后平板上没有长菌！最终怀疑质粒没切开。然后分别分布酶切了质粒和片段。之后连接，结果长了几十个菌落。开始还挺高兴。可是提取重组质粒后酶切没发现目的片段，只有载体片段，但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段。。。。我很郁闷啊 ，都做了几个月了不知道原因，求各位高手帮助！感激不尽！
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1楼 2013-03-21 20:21:25
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15376763881

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2013-03-24 05:47:05
一个酶打开，另外一个酶没有切开，如果用这种载体做连接反应
平板上肯定会长菌，相当于载体自连哦
这两个酶都挺好用的，你还是从引物开始检查，到底是什么问题吧...

非常感谢您啊 我这也怀疑是不是一种酶不好用了,因为ecor1不是新买的，上届师姐师兄留下的，xho1是新买的。我也想问的问题就是，如果一个酶切开了而另一个酶没有切开，发生载体自连，像您说的那样会长菌？（我的长了几十个菌。）很可能就是这样，要不测序怎么会是空载体呢。。引物是一个老师帮我看过也。
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10楼2013-03-24 09:27:20
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-03-22 00:34:05
15376763881: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-23 09:00:24
1.“但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段”  你应该具体说下是怎么做的pcr，你测序了吗？
“最终怀疑质粒没切开”那怎么会不长菌？ 阴性对照肯定长得
用更远的酶切有看见目标大小条带么，如果你的酶切步骤发生star activity，那么很多时候还是能连上，但是序列就全变了。确认你切DNA前，里面没有混什么酒精之类的，另外我一般就切1hrs

2. 试验其他酶，或者换比如EcoRI-HF这种降低star activity的
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2楼2013-03-21 22:20:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
15376763881: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-23 09:07:54
重组质粒PCR时是否做了阴性对照？PCR可能有假阳性的。还有，你的重组质粒大小是否正确？用其他酶切是否可以切下目的片段？
我认为很可能是构建的问题，两个酶的用量没问题吧，酶切载体是否做了胶回收？我看你最好重新做酶切连接。
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3楼2013-03-22 01:49:03
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15376763881

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-03-21 22:20:07
1.“但是做重组质粒pcr能跑出很亮的和目的片段大小片段”  你应该具体说下是怎么做的pcr，你测序了吗？
“最终怀疑质粒没切开”那怎么会不长菌？ 阴性对照肯定长得
用更远的酶切有看见目标大小条带么，如果你的酶 ...

我pcr程序应该没问题。模版是提取的待检重组质粒2微升，上下游引物各1微升，premixed 12.5微升，水8.5. 我测序了待检的重组菌液，可是结果显示是空质粒。   我想问，如果一个酶切开，而另一个酶没有切开质粒肯定也连接不上，平板上应该不会长菌吧？我没用更远的酶切，您说的星号活性是酶切时间久了可能出现吧？
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4楼2013-03-23 09:07:04
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